单核RNA测序技术揭示了中风后人脑中的星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞

《Experimental Neurology》：Single-nuclei RNA sequencing unveils astrocyte and oligodendrocyte lineage cells in post-stroke human brain

脑脊液出血（SAH）导致血脑屏障破坏、神经炎症和神经元凋亡，单次FTY720（0.5 mg/kg）治疗后72小时显著改善血脑屏障完整性，抑制微胶质和星形胶质细胞NF-κB/iNOS通路激活，减少海马和皮层神经元凋亡。

　　### 研究背景与意义

蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH）是一种严重的出血性脑卒中类型，其特点是脑血管破裂导致血液进入蛛网膜下腔，从而引发一系列复杂的病理生理变化。SAH的发生通常与动脉瘤破裂或外伤性脑损伤有关，其后果包括高发病率和高死亡率。据研究统计，SAH约占所有脑卒中的5%，但其死亡率却高达约50%。即便存活下来，许多患者仍会经历长期的神经功能障碍，如认知功能下降、抑郁、癫痫、头痛以及运动功能受损等。目前，SAH的唯一已知药物治疗方法是尼莫地平（nimodipine），但其疗效有限，且可能因影响血压和胃肠功能而限制使用。因此，寻找新的、有效的药物治疗方案对于改善SAH患者的预后具有重要意义。

SAH的发病机制涉及多种因素，其中早期炎症反应被认为在延迟性神经功能恶化中起关键作用。当脑血管破裂时，血液中的有毒成分会释放到脑组织中，激活固有免疫反应，特别是通过表达于小胶质细胞和星形胶质细胞上的Toll样受体（如TLR2和TLR4）。这种炎症反应不仅导致小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，还引发炎症介质的释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO），这些介质与血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）功能障碍、微血管调节异常、微血栓形成和脑血管痉挛等现象相关，而这些现象已被证实是SAH后继发性脑损伤的重要诱因。因此，针对早期炎症反应进行干预，可能成为治疗SAH的重要策略。

### Fingolimod的作用机制与研究意义

Fingolimod（FTY720）是一种口服生物利用度高、具有免疫调节作用的药物，最初被用于治疗多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）。其主要作用机制是通过调节鞘氨醇-1-磷酸（S1P）受体，影响免疫细胞的迁移。然而，近年来的研究发现，FTY720不仅能通过S1P受体1的下调将免疫细胞滞留在外周淋巴结中，还能有效穿过血脑屏障，作用于中枢神经系统（central nervous system, CNS）内的多种细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。这一特性使其在脑卒中等中枢神经系统疾病的研究中展现出巨大潜力。

在SAH的动物模型研究中，FTY720已被证实能够减少外周白细胞的早期粘附，维持脑皮层动脉的扩张功能，并改善神经功能结局。此外，FTY720还能降低SAH后小胶质细胞的数量，从而减轻炎症反应。然而，尽管这些研究揭示了FTY720对SAH的潜在益处，其在脑内细胞层面的具体作用机制仍需进一步探索。本研究旨在深入探讨FTY720在SAH后对血脑屏障完整性、小胶质细胞和星形胶质细胞的激活状态、下游促炎信号通路以及神经元凋亡的具体影响，从而更全面地理解其神经保护作用的机制基础。

### 实验方法与设计

本研究采用6-8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠作为实验对象，遵循国家卫生研究院（NIH）和2020年动物研究的ARRIVE指南（ARRIVE 2.0），并获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（协议编号：18–110）。实验过程中，所有大鼠均在恒定的温度、湿度和12小时光照-黑暗循环环境中饲养，自由获取食物和水。实验分为三个组别：（1）假手术组（sham group）：仅进行手术操作，不进行动脉穿刺；（2）SAH-载体组（SAH-vehicle group）：进行SAH诱导手术，并在术后给予生理盐水；（3）SAH-FTY720组：在SAH诱导手术后3小时给予单次剂量的FTY720（0.5 mg/kg），以模拟急性干预的时间窗口。

为了评估血脑屏障的功能状态，研究者采用 Evans 蓝染色法测量 Evans 蓝在脑组织中的扩散情况，并通过湿干法测定脑水肿体积。同时，使用Western blot和免疫荧光染色技术检测小胶质细胞和星形胶质细胞的激活状态，以及促炎信号通路相关蛋白（如iNOS和NF-κB）的表达水平。此外，通过TUNEL染色和NeuN标记，评估神经元的凋亡情况。

实验设计中，研究者关注的是SAH后2天和7天的神经病理变化，因为SAH后的炎症反应和血脑屏障损伤通常在这些时间点达到高峰。所有分析均由对实验分组不知情的研究人员完成，以确保结果的客观性。通过这些方法，研究者能够全面评估FTY720在SAH中的作用机制，并为未来的临床应用提供理论依据。

### 实验结果与分析

研究结果表明，FTY720在SAH后对血脑屏障的保护作用显著。在SAH-载体组中，Evans蓝在脑组织中的扩散量为12.10 ± 0.24 μg/g组织，而FTY720治疗组（SAH-FTY720）的扩散量为5.60 ± 0.43 μg/g组织，与假手术组（3.70 ± 0.12 μg/g组织）相比具有显著差异（p < 0.0011）。这表明FTY720能够有效减少血脑屏障的破坏，从而降低脑水肿的发生率。在SAH-载体组中，脑水肿体积达到85.80 ± 0.86%，而FTY720治疗组的脑水肿体积为76.20 ± 0.80%，显著低于SAH-载体组（p = 0.0387）。

此外，FTY720对小胶质细胞和星形胶质细胞的激活状态也有显著影响。在SAH-载体组中，小胶质细胞标记物Iba-1和星形胶质细胞标记物GFAP的表达均显著增加（p < 0.0001），而FTY720治疗组的表达水平显著下降（p < 0.0001）。这说明FTY720能够抑制SAH后这些细胞的激活，从而减轻炎症反应。

研究还发现，FTY720能够减少iNOS（诱导型一氧化氮合酶）的表达，而iNOS的过度激活会导致一氧化氮的大量生成，进而引发氧化应激和神经元死亡。在SAH-载体组中，iNOS在皮层和海马区的表达显著增加，而在FTY720治疗组中，iNOS的表达水平显著降低。这进一步支持了FTY720通过抑制NF-κB/iNOS信号通路来减轻炎症反应和神经损伤的机制。

在神经元凋亡方面，FTY720同样表现出显著的保护作用。与假手术组相比，SAH-载体组的NeuN（神经元特异性核蛋白）表达显著降低，而在FTY720治疗组中，NeuN的表达水平有所恢复。通过TUNEL染色，研究者发现SAH-载体组中神经元的凋亡率显著增加，而FTY720治疗组的凋亡率显著下降。这些结果表明，FTY720不仅能够减少炎症反应，还能有效保护神经元免受凋亡。

### 讨论与研究启示

SAH的病理过程涉及多个复杂的机制，其中血脑屏障的破坏和炎症反应是导致神经功能恶化的关键因素。本研究的结果表明，FTY720能够通过多种机制减轻这些病理变化。首先，它通过减少小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，抑制促炎信号通路（如NF-κB/iNOS）的过度激活，从而降低炎症介质的释放。其次，FTY720能够改善血脑屏障的完整性，减少脑水肿的发生。最后，它通过减少神经元凋亡，保护神经元免受进一步损伤。

尽管FTY720在SAH动物模型中显示出良好的神经保护作用，但目前尚未在SAH患者中进行充分的临床试验。因此，本研究的结果为未来的临床试验提供了重要的理论支持。此外，FTY720的作用机制不仅限于小胶质细胞，还涉及星形胶质细胞和其他中枢神经系统细胞，这提示其可能具有更广泛的神经保护作用。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，研究仅使用了雄性大鼠，而SAH在女性中更为常见，因此未来的研究需要进一步探讨FTY720在雌性动物中的作用。此外，本研究仅评估了SAH后7天的神经功能变化，而长期的神经功能恢复情况仍需进一步研究。最后，尽管FTY720在SAH动物模型中表现出良好的效果，但其具体作用机制仍需通过特定的药理学抑制剂或基因操作进一步验证。

### 研究结论与未来展望

综上所述，FTY720在SAH动物模型中表现出显著的神经保护作用。通过改善血脑屏障完整性、抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、减少促炎信号通路的过度表达以及降低神经元凋亡，FTY720为SAH的治疗提供了新的思路。本研究的结果进一步支持了FTY720在SAH中的潜在应用价值，并为未来的临床试验奠定了基础。

尽管FTY720在SAH动物模型中显示出良好的效果，但其在人类中的应用仍需更多的研究支持。未来的研究可以进一步探讨FTY720在不同性别和不同时间点的治疗效果，并结合更精确的剂量控制和更广泛的细胞类型分析，以全面揭示其神经保护机制。此外，结合其他药理学手段和基因编辑技术，可以更深入地研究FTY720对NF-κB/iNOS信号通路的具体影响，从而为SAH的治疗提供更坚实的理论基础和临床证据。