单细胞长读长全基因组测序揭示人脑中转座子的体细胞活性

《Communications Biology》：Single cell long read whole genome sequencing reveals somatic transposon activity in human brain

本研究通过开发单细胞长读长全基因组测序(scWGS-LR)技术，结合优化的生物信息学流程，首次在18个人脑单细胞中系统鉴定了SNV、InDel和结构变异(SV)，特别揭示了转座子(TE)介导的体细胞突变（如Alu/LINE-1）通过非等位基因同源重组(NAHR)机制在神经组织中的活跃性，为神经退行性疾病（如多系统萎缩MSA）的分子机制提供了新的见解。

　　

当我们凝视人类大脑的复杂性时，一个长期困扰科学家的问题是：单个神经元之间的基因组是否存在差异？这种被称为体细胞突变的现象，可能像暗流一样影响着大脑的功能和疾病的发生。传统的短读长测序技术虽然能捕捉大型染色体变异，却对中小型变异——尤其是占人类基因组27%的转座子（Transposable Elements, TE）相关的突变——显得力不从心。这些"基因组跳跃者"在神经发育和退行性疾病中扮演着关键角色，但其在单细胞水平的活动图谱始终是个谜。

为了揭开这层迷雾，由Michal B. Izydorczyk等来自贝勒医学院和伦敦大学学院的研究团队在《Communications Biology》上发表了突破性研究。他们开发了一套创新的单细胞长读长全基因组测序（scWGS-LR）技术，结合牛津纳米孔（ONT）测序平台，对来自三个大脑（包括两个多系统萎缩MSA病例和一个对照）的18个单细胞进行了深入分析。这项研究不仅建立了首个脑内转座子活性的单细胞分辨率图谱，更揭示了转座子通过非等位基因同源重组（NAHR）机制促进结构变异的新见解。

研究人员首先通过细胞筏（CellRaft）设备分离单细胞核，采用液滴多重置换扩增（dMDA）技术进行全基因组扩增（WGA），显著降低了扩增偏好性。他们创新性地比较了两种建库策略：T7内切酶去支链法和快速条形码PCR（RBP）法。结果显示，PromethION测序平台相比MinION产生更高产量（6500万条读数 vs 1900万条读数），其中T7法制备的文库能保留更长的读长（N50达2.8 kb），覆盖了高达46%的人类基因组区域。

在方法学验证阶段，团队利用基因组标准品（GIAB HG002）进行基准测试，SNV/InDel检测的F值达到93.4%。通过定制化的生物信息学流程，他们成功克服了MDA扩增产生的嵌合体假阳性问题，特别是在结构变异检测方面达到了87.8%的准确率。这种严谨的质控为后续发现奠定了坚实基础。

研究结果

基因组覆盖与变异检测验证

通过比较单细胞与批量测序数据，研究发现单细胞数据中80%以上的SNV/InDel与批量数据共享。有趣的是，单细胞特有的变异中，8.6%在深度测序的批量样本中得到验证，且这些变异不显示MDA错误特征（C>T突变为主），表明是真实的体细胞克隆事件。在LRRK2等神经退行性疾病相关基因中，发现了31个单细胞特有的外显子变异，提示这些基因可能更易发生体细胞突变。

结构变异与转座子活性

研究团队在单细胞中平均鉴定出2250个插入和2821个缺失，其中78.5%的插入和50.9%的缺失在批量样本中得到验证。特别值得注意的是，单细胞特有的缺失数量是插入的5.73倍，这与批量测序中观察到的插入偏好形成鲜明对比。通过转座子注释分析，发现AluY家族在批量验证的插入中占主导（69%），而单细胞特有的插入则以AluS家族为主（55%）。

NAHR介导的缺失事件

研究证实了转座子倾向于插入到同家族元件的基因组区域，Alu和LINE-1分别显示3.26倍的富集。更重要的是，团队鉴定了56个由Alu配对和76个由LINE-1配对介导的NAHR缺失事件，这些事件在单细胞中完整存在，而在批量样本中仅显示低频率嵌合性。其中一个典型例子是ACTL6A基因内的缺失，该基因与智力残疾和斜颈相关。

技术方法创新

本研究的关键技术突破包括：1）优化dMDA单细胞扩增 protocol；2）建立T7去支链与RBP双建库策略；3）开发针对嵌合体识别的生物信息学过滤流程；4）利用PromethION高通量测序平台提升长读长覆盖率。样本来源于伦敦皇后广场脑库的冷冻尸脑组织（30-50 mg），通过伦理审查（07/MRE09/72）。

研究结论与意义

这项研究首次在单细胞水平描绘了人脑中转座子介导的体细胞突变全景图，证实了NAHR是神经元基因组不稳定的重要机制。研究发现脑组织相比T细胞具有更高的缺失/插入比例（5.73倍），这可能与神经元有限的再生能力相关。虽然样本量限制了对MSA特异性的结论，但研究建立的scWGS-LR技术框架为未来神经退行性疾病的体细胞突变研究提供了强大工具。这些发现不仅深化了对脑基因组动态性的理解，更为开发针对转座子活性的治疗策略提供了新思路。