《Molecular and Cellular Neuroscience》：Agrimonolide exhibits anti-neuroinflammatory potential via TLR4-mediated pathways
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本研究发现agrimonolide通过抑制NF-κB和MAPK信号通路减轻小胶质细胞和星形胶质细胞活化，改善LPS诱导的神经炎症，为神经炎症相关疾病治疗提供新策略。
李伟玲|彭倩|孙平|向凌毅|齐扬新|叶贤生|史颖颖|胡松|陈海峰|孙彬莲
中国武汉江汉大学医学院生物医学科学研究所认知与情感障碍重点实验室
摘要
小胶质细胞和星形胶质细胞的激活是神经炎症反应的主要原因，这种反应会损害神经元，从而导致神经系统疾病。目前，在临床实践中直接针对神经炎症的药物很少，这突显了对有效抑制剂的迫切需求。在这项研究中，我们从40种化合物中筛选出阿格里莫诺利德（agrimonolide）作为胶质细胞激活的抑制剂，并进一步在体外和体内验证了其有效性。在细胞模型中，阿格里莫诺利德显著降低了LPS刺激的BV2小胶质细胞和原代星形胶质细胞中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNFα）的表达水平。机制研究表明，阿格里莫诺利德抑制了NF-κB和MAPK信号通路的激活。结合分子对接结果，推测阿格里莫诺利德可能具有多个作用靶点。在ICR小鼠中，我们的测量结果显示，阿格里莫诺利德处理显著减少了LPS诱导的胶质细胞激活，这通过IBA-1和GFAP蛋白的水平得到证实。此外，它还显著抑制了TLR4介导的信号通路。我们的发现表明，阿格里莫诺利德通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活来抑制神经炎症反应，为神经炎症相关疾病的治疗策略提供了新的见解。
引言
阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病对全球健康构成了重大挑战。研究表明，中枢神经系统（CNS）的神经炎症在神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用（Yao等人，2019年）。小胶质细胞和星形胶质细胞作为CNS的常驻免疫细胞，对于先天免疫反应至关重要，是抵御毒素和促炎刺激的第一道防线（Singh，2022年）。作为吞噬细胞，小胶质细胞通过清除正常大脑中的受损神经元和细胞碎片来发挥神经保护作用（Donaldson等人，2020年）。同样，星形胶质细胞在稳态条件下维持神经元稳态（Vilhardt，2005年）。然而，在异常激活的情况下，这些细胞会释放多种促炎介质和细胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS（Singh，2022年），这些因子的高水平会导致突触退化、神经元死亡和认知障碍，所有这些都与神经退行性疾病密切相关（Stephenson等人，2018年）。因此，抑制神经炎症反应是治疗神经炎症相关疾病的一个潜在途径。
脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞激活会触发炎症反应，加速疾病进展（Tanaka等人，2006年），这一过程由TLR4（Toll样受体4）复合体启动，该复合体对LPS诱导的先天免疫反应至关重要。LPS与小胶质细胞和星形胶质细胞上的TLR4结合，招募MyD88，引发包括IL-1受体相关激酶-1/4（IRAK1/4）和TNF受体相关因子6（TRAF6）在内的信号级联反应，从而导致下游信号通路（如丝裂原活化蛋白激酶MAPK，主要涉及JNK和p38）和核因子κB（NF-κB）的激活（Masson等人，2015年；Leitner等人，2019年），这些因子在神经退行性疾病的CNS中调节促炎细胞因子的表达水平（Yao等人，2018年）。因此，干扰TLR与LPS或其下游信号通路之间的相互作用是一种有前景的治疗策略，可以通过LPS诱导的神经炎症细胞或动物模型进行评估。
目前，临床试验中缺乏成功的抗神经炎症药物。草药长期以来一直被用于改善神经症状（Cui等人，2023年），而草药的结构多样性使它们成为新型先导化合物的宝贵来源。阿格里莫诺利德主要从传统中药Agrimonia pilosa Ledeb中提取，具有多种药理活性，包括抗炎作用（Chen等人，2016年）、肝脏保护作用（Park等人，2004年）、α-葡萄糖苷酶抑制作用（Park和Kang，2020年；Teng等人，2016b年）以及心肌保护作用（Zhao和Hu，2021年；Wang等人，2022年）。先前的研究表明，根据ADMET预测，阿格里莫诺利德具有中等程度的血脑屏障穿透能力（Huang等人，2023年）。这些发现表明，阿格里莫诺利德作为抗神经炎症剂具有很大的潜力。
在这项研究中，我们证明了阿格里莫诺利德可以减少星形胶质细胞和小胶质细胞中的炎症反应，分子机制研究表明，阿格里莫诺利德能够抑制LPS诱导的TLR4介导的信号通路。此外，接受阿格里莫诺利德处理的ICR小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞激活显著减少，海马体和皮层中的促炎细胞因子水平也有所下降。这些发现表明，阿格里莫诺利德可能成为治疗神经炎症相关疾病的有希望的化合物。
实验部分
细胞培养和小鼠实验
BV2小鼠小胶质细胞和Neuro-2a（N2a）神经元细胞分别培养在RPMI-1640和DMEM（Gibco，美国）培养基中，添加10%胎牛血清（FBS，内毒素≤5 EU/mL，Gibco，美国），并在5% CO?培养箱中培养。对于小鼠原代星形胶质细胞和小胶质细胞的分离和培养：无菌解剖3天大的C57BL/6小鼠的脑皮层，并小心去除脑膜。然后将组织切碎，再用0.1%胰蛋白酶进行酶消化
阿格里莫诺利德可能抑制LPS刺激的BV2细胞的NF-κB信号通路
NF-κB信号通路是LPS刺激后的主要激活通路，在包括神经炎症在内的炎症性疾病中起着关键作用（Shabab等人，2017年）。磷酸化P65（p-P65）的水平通常用作NF-κB激活的指标。为了筛选干扰神经炎症的化合物，我们将小鼠小胶质细胞BV2与LPS以及我们库中的40种化合物共同处理，然后通过Western blot检测p-P65的水平。讨论
在这项研究中，我们证明了阿格里莫诺利德主要通过抑制NF-κB和MAPK信号通路来抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。分子对接结果表明，阿格里莫诺利德可能与TLR4信号通路中的关键上游成分相互作用，从而调节复杂的神经炎症网络。我们还证实，阿格里莫诺利德能有效减少ICR小鼠中的LPS诱导的神经炎症。因此，这些结果表明阿格里莫诺利德具有潜力
作者贡献声明
孙平：数据管理，撰写——初稿。向凌毅：方法学，数据管理。齐扬新：验证，方法学。叶贤生：验证，软件。史颖颖：监督，方法学。胡松：资源，概念化。孙彬莲：资金获取，概念化，撰写——审阅与编辑。李伟玲：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿。彭倩：撰写——审阅与编辑。
资助
本工作得到了江汉大学的科研启动资金（编号：08190001；06101002）和江汉大学科研项目资助（编号：2023JCYJ14）的支持。
未引用的参考文献
Giovannoni和Quintana，2020
Liu等人，2022
Teng等人，2016a
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
