免疫蛋白酶体通过调控C1q补体激活、吞噬功能及细胞因子释放介导小胶质细胞先天免疫反应的关键特征

《Scientific Reports》：Key features of the innate immune response is mediated by the immunoproteasome in microglia

本研究针对神经炎症调控难题，聚焦小胶质细胞中免疫蛋白酶体的非经典功能。研究人员通过药理学抑制和基因敲除手段，发现免疫蛋白酶体缺失可显著抑制IFNγ诱导的补体激活因子C1q表达、削弱吞噬功能，并选择性调节CXCL10/IP-10、MIG/CXCL9、MCP-1/CCL2和RANTES/CCL5等趋化因子产生。更深入机制研究揭示免疫蛋白酶体通过调控IκBα降解影响NF-κB信号通路活化，而NADH预处理可通过稳定 constitutive proteasome 阻断免疫蛋白酶体组装。该研究为神经退行性疾病及中枢神经系统损伤的免疫调节治疗提供了新靶点。

　　

当我们的大脑或脊髓受伤时，一群特殊的免疫细胞——小胶质细胞会立即进入“战斗状态”。作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，它们负责启动快速的先天免疫反应：激活补体系统来标记病原体，通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放细胞因子招募更多免疫细胞。然而，这把“双刃剑”如果过度激活，反而会加剧神经损伤，甚至促进阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的发展。因此，精确调控小胶质细胞的炎症反应已成为神经科学领域的重要挑战。

在这其中，免疫蛋白酶体作为细胞内重要的蛋白质降解机器，长期以来被认为主要参与抗原呈递等适应性免疫过程。但在小胶质细胞中，它是否也调控着更快速的先天免疫反应？这正是美国Uniformed Services University的Burnett团队在《Scientific Reports》上发表的最新研究要解答的核心问题。

为了回答这一问题，研究人员采用了多种技术手段。他们使用小鼠小胶质细胞系BV-2和人多能干细胞诱导分化的小胶质细胞作为研究模型，通过药理学抑制剂ONX-0914和CRISPR/Cas9基因编辑技术特异性靶向免疫蛋白酶体催化亚基β5i。研究团队运用定量PCR、蛋白质印迹、流式细胞术、吞噬功能测定、细胞因子芯片分析和核质分离等技术，系统评估了免疫蛋白酶体在补体激活、吞噬功能和细胞因子产生等方面的作用，并深入探讨了其通过NF-κB信号通路调控炎症反应的分子机制。

免疫蛋白酶体抑制降低IFNγ依赖性补体级联激活

研究发现，IFNγ处理能显著上调补体系统关键启动因子C1q的三个亚基基因表达，而这种诱导效应在ONX-0914处理或β5i基因敲除的BV-2细胞中被完全阻断。蛋白质水平分析进一步证实，IFNγ依赖的C1q蛋白上调在β5i敲除细胞中显著减弱。此外，免疫蛋白酶体抑制还降低了补体成分C3的基础表达水平，并抑制了IFNγ对C3的诱导作用。有趣的是，虽然补体激活因子受到免疫蛋白酶体调控，但补体受体的表达水平并未发生显著变化，表明免疫蛋白酶体主要影响补体激活过程而非其识别机制。在人多能干细胞诱导的小胶质细胞中，研究人员观察到了类似的调控模式，证实了这一现象在不同物种间的保守性。

免疫蛋白酶体抑制延缓吞噬作用

吞噬功能作为先天免疫的核心环节，同样受到免疫蛋白酶体的精细调控。研究团队通过多种实验方法证实，ONX-0914处理或β5i基因敲除均显著降低了小胶质细胞对IgG包被乳胶微珠的吞噬能力。更重要的是，当使用表达GFP的大肠杆菌作为更接近生理状态的吞噬底物时，免疫蛋白酶体抑制同样削弱了细胞的细菌清除能力。这些发现表明，免疫蛋白酶体对吞噬功能的调控具有普适性，可能通过影响吞噬过程的共同细胞机制而非特定受体通路实现。

IFNγ依赖性细胞因子受免疫蛋白酶体调控

通过细胞因子芯片分析，研究人员发现免疫蛋白酶体对细胞因子释放的调控具有高度选择性。在IFNγ诱导的11种上调细胞因子中，仅有CXCL10/IP-10、MIG/CXCL9、MCP-1/CCL2和RANTES/CCL5这四种趋化因子的表达受到免疫蛋白酶体特异性调控。这些因子均参与免疫细胞趋化和活化，特别是在神经炎症中促进小胶质细胞向损伤部位迁移及外周免疫细胞募集。值得注意的是，在β5i敲除细胞中，这些趋化因子的IFNγ依赖性诱导同样被阻断，证实了免疫蛋白酶体在其中的特异性作用。人iPSC来源小胶质细胞的实验进一步验证了除MIG外，其余三种趋化因子在人类细胞中同样受免疫蛋白酶体调控。

先天免疫反应改变源于免疫蛋白酶体对NF-κB的调控

为进一步阐明机制，研究人员探索了免疫蛋白酶体与NF-κB信号通路的关联。NF-κB是调控多种炎症因子的关键转录因子，其活化需要抑制蛋白IκBα的降解。时间进程实验显示，IFNγ处理20分钟后，野生型BV-2细胞中IκBα蛋白水平显著下降，表明NF-κB通路激活；而在β5i敲除细胞中，IκBα降解受阻，NF-κB活化受到抑制。核质分离实验进一步证实，免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914能够阻断IFNγ诱导的p65核转位。下游基因分析发现，NF-κB靶基因COX-2的表达在免疫蛋白酶体抑制后同样降低，为免疫蛋白酶体调控NF-κB通路提供了更多证据。

Individual comparisons indicated by asterisks likely used a t-test(n=4,p<.05, ns=no significance).(C) NF-kB nuclear translocation was measured in BV-2 cells in the presence or absence of IFNy and/or ONX-0914 by comparing the nuclear to cytoplasmic p65 ratios between groups. An ANOVA revealed a significant difference between groups using one-way ANOVA([F(3,8)=11.67],p=.002,n=3). Tukey's HSD post hoc analysis revealed that IFNy treatment increased p65 nuclear to cytoplasmic ratio compared to control(p=.014). Co-treatment with IFNy and ONX-0914 significantly decreased NF-kB activation compared to IFNy treatment alone(p=.002), suggesting that immunoproteasome inhibition blocks the IFNy-dependent activation of NF-kB.(D) Gene expression analysis of cox2 expression by qRT-PCR.Statistical significance between groups(n=5) was determined using an independent samples t-test(p<.001,**p<.0001,ns=no significance).'>

NADH降低免疫蛋白酶体水平和补体基因表达

研究还探讨了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在调节免疫蛋白酶体中的作用。NADH已被报道能稳定 constitutive proteasome，而本研究发现在IFNγ刺激前用NADH预处理细胞，可有效抑制免疫蛋白酶体亚基β5i的表达和免疫蛋白酶体的组装。功能实验表明，NADH处理同样能抑制IFNγ诱导的C1qa补体基因表达，这为通过代谢物调控免疫蛋白酶体活性提供了新思路。

β5iprotein levels compared to all groups(Control,p=.006; NAD,p<.001; NADH+IFNg,p<.0001).Further,IFNy did not significantly increaseβ5i protein levels in cells pre-treated with NADH(p=.997,t-test comparing two groups).(B) Assembled immunoproteasomes(20i represents purified positive control) were measured using native gel electrophoresis. Analysis revealed that there was a significant difference between treatment groups using one-way ANOVA([F(3,11)=9.845],p=.002,n=4).Tukey's HSD post hoc analysis revealed that IFNy increased the amount of assembled immunoproteasomes compared to all treatment groups(Control,p=.003;NADH,p=.004;NAD+IFNy,p=.009).Interestingly, when cells are pre-treated with NADH,immunoproteosomes are not increased in response to IFNy(p=.996,t-test comparing two groups).(C) To determine if NADH treatment would successfully reduce complement activation in BV-2 cells, we pre-treated with NADH, then measured gene expression of complement activator C1qa. An ANOVA revealed a significant treatment effect using one-way ANOVA([F(3,12)=48.22,p<.001).Tukey's HSD post hoc analysis revealed a significant increase of C1qa gene expression in response to IFNy treatment(p<.001), an effect that was reduced by NADH pre-treatment(p=.049).'>

本研究系统阐明了免疫蛋白酶体在小胶质细胞先天免疫反应中的核心地位。研究发现，免疫蛋白酶体通过调控补体激活、吞噬功能和特异性细胞因子释放，全面影响小胶质细胞的免疫功能。在机制上，免疫蛋白酶体可能通过影响IκBα降解进而调节NF-κB信号通路活性，这为理解其调控炎症反应的分子基础提供了重要线索。

特别值得注意的是，免疫蛋白酶体对先天免疫的调控具有高度选择性，如仅影响部分趋化因子而非全部炎症介质，这种特异性为靶向免疫蛋白酶体进行精准免疫调控提供了可能。此外，NADH能够抑制免疫蛋白酶体组装及后续补体激活的发现，将细胞代谢与免疫调控联系起来，为通过代谢干预调节神经炎症开辟了新途径。

在神经退行性疾病如阿尔茨海默病中，小胶质细胞介导的补体激活和突触修剪过度是导致突触丢失的重要原因。而病理性吞噬活动可能加剧神经元死亡，促进神经退行性进程。因此，精准调控免疫蛋白酶体活性可能成为维持适当免疫反应与避免过度炎症损伤的关键平衡点。

这项研究不仅拓展了对免疫蛋白酶体非经典功能的认识，也为开发针对神经炎症性疾病的新治疗策略提供了理论依据。通过靶向免疫蛋白酶体调控小胶质细胞的先天免疫功能，未来可能为阿尔茨海默病、帕金森病、创伤性脑损伤等疾病的治疗提供新的干预思路。