DNAJB6通过调控FUS相分离凝胶化抑制神经毒性的多重神经退行性蛋白毒性平台研究

《Nature Communications》：Multiplex neurodegeneration proteotoxicity platform reveals DNAJB6 promotes non-toxic FUS condensate gelation and inhibits neurotoxicity

本研究针对神经退行性疾病（NDDs）中蛋白毒性聚集的难题，开发了基于酵母的多重遗传筛选平台，系统筛选了32种NDDs相关蛋白与132种分子伴侣的相互作用。研究发现分子伴侣DNAJB6能有效缓解肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆（ALS/FTD）相关RNA结合蛋白（FUS、TDP-43、hnRNPA1）的毒性，并通过共相分离将FUS condensates锁定于凝胶态抑制纤维化。深度突变扫描鉴定出DNAJB6关键活性位点，动物实验证实其过表达可挽救FUS-ALS小鼠运动神经元丢失及小胶质细胞活化，为NDDs治疗提供了新靶点。

　　

神经退行性疾病（NDDs）如肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是全球性的健康挑战，其共同特征是错误折叠蛋白在神经元内聚集形成毒性聚集体。以FUS、TDP-43为代表的RNA结合蛋白（RBPs）的异常相变和纤维化是疾病进展的关键环节。然而，由于疾病模型的异质性和筛选技术的局限性，以往研究难以系统揭示调控这些蛋白毒性的通用机制。传统酵母模型虽能模拟蛋白毒性，但一次仅能研究单一模型，且多筛选酵母基因库，其成果向哺乳动物模型转化存在障碍。此外，患者突变是否改变蛋白毒性调控机制亦不明确。

为突破这些限制，研究团队在《Nature Communications》发表了题为"Multiplex neurodegeneration proteotoxicity platform reveals DNAJB6 promotes non-toxic FUS condensate gelation and inhibits neurotoxicity"的研究，开发了一种酵母多重筛选平台。该平台通过DNA条形码技术并行追踪32种NDDs相关蛋白在132种分子伴侣及约900种人类蛋白库作用下的生长恢复情况，结合定制化分析流程，高效鉴定出广泛性与特异性毒性调控因子。

研究关键技术包括：1） 建立DNA条形码标记的酵母模型库，实现多重并行生长表型筛选；2） 利用人类ORFeome V8.1 cDNA文库进行无偏倚遗传筛选；3） 结合荧光寿命成像（FLIM）、原子力显微镜（AFM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等多尺度生物物理技术分析蛋白相变行为；4） 通过深度突变扫描（DMS）绘制DNAJB6功能图谱；5） 使用AAV9介导的基因递送在FUS-ALS小鼠模型进行体内验证。

结果

Development of a multiplexed screening strategy to identify rescuers of proteotoxicity

研究构建了包含32种NDDs相关蛋白（含家族性突变体）的酵母模型库，每种模型通过5-7个独特DNA条形码标记。通过混合培养与高通量测序分析条形码丰度变化，定量评估遗传调控因子对蛋白毒性的抑制效果。优化后的平台灵敏度达66%，特异性达99%，显著优于传统单模型筛选。

Functional characterization of chaperone interactions with neurodegenerative disease models

筛选发现分子伴侣HSP104变体可广泛挽救多种模型毒性，而酵母HSP40伴侣YDJ1、CCT6等则特异性作用于ALS/FTD相关RNA结合蛋白。人类伴侣筛选中，线粒体伴侣DNAJC11能挽救TMEM106B和β-淀粉样蛋白模型，提示其通过缓解线粒体应激发挥作用。值得注意的是，II型HSP40伴侣（如DNAJB1、DNAJB2、DNAJB4、DNAJB6、DNAJB8）均能调控酵母朊病毒RNQ1和SUP35，表明错误折叠朊病毒可能是DNAJB家族的进化保守底物。

DNAJB6 is a rescuer of multiple RNA-binding proteins implicated in ALS/FTD

DNAJB6在筛选中展现出对FUS、TDP-43和hnRNPA1毒性的强效挽救作用。在HEK293T细胞中，DNAJB6过表达显著减少这些蛋白的SDS不溶性聚集物形成。RNA测序显示FUS和TDP-43过表达可诱导DNAJB6转录上调，且DNAJB6敲除细胞中RBPs不溶性聚集增加，证实其在内源性应激响应中的关键作用。

DNAJB6 undergoes phase separation and can prevent aberrant FUS condensation in vitro

纯化实验揭示DNAJB6自身可发生液-液相分离（LLPS），并与FUS共分区形成更小、更稳定的液滴。荧光恢复后光漂白（FRAP）显示DNAJB6加速FUS凝聚体早期动态交换。荧光寿命成像（FLIM）发现DNAJB6能维持FUS凝聚体较长荧光寿命，抑制其随时间推移的粘度增加。联络线梯度分析表明DNAJB6以3.0±1.2μM/μM FUS的梯度优先分配至FUS凝聚体，通过异型FUS-DNAJB6相互作用替代同型FUS-FUS相互作用，阻止凝聚体固化和纤维化形成。

pFTAA staining, AFM, and FTIR studies of the effect of DNAJB6 on FUS condensates

pFTAA染色显示DNAJB6抑制FUS凝聚体中交叉β-片层结构积累。原子力显微镜（AFM）测得其杨氏模量在48小时内保持约40kPa，而FUS单独组升至25000kPa，证实DNAJB6阻止了液体向固体转变。傅里叶变换红外光谱（FTIR）及纳米红外光谱（AFM-IR）进一步揭示DNAJB6使FUS多肽链保持无规卷曲构象，促进形成扩展链平行β-片层，从而稳定凝胶态。

Characterization of DNAJB6 via domain deletions and deep mutational scanning

结构域删除实验表明DNAJB6的J结构域（H31Q突变）、G/F富集区及S富集区均为其功能所必需。深度突变扫描（DMS）鉴定出关键酸性氨基酸残基（如D158）及增强型突变（G182E、S192T）。这些突变体在哺乳动物细胞中展现出比野生型更强的不溶性FUS聚集抑制能力。

DNAJB6 rescues motor neuron loss and associated microgliosis in an animal model of ALS-FUS

在FUS P517L/D14双突变ALS小鼠模型中，AAV9介导的DNAJB6表达显著挽救了6月龄小鼠脊髓L4-L5节段的运动神经元丢失及小胶质细胞活化，证实其体内治疗潜力。

讨论

本研究通过创新性多重筛选平台，揭示了DNAJB6作为一种广谱性神经保护伴侣的新机制：其通过共相分离将致病性RBPs锁定于可逆的凝胶态，阻止其向不可逆纤维化聚集转变。该发现不仅阐明了生物分子凝聚体调控的新范式，也为开发以相变为靶点的神经退行性疾病治疗策略提供了直接依据。DNAJB6深度突变扫描获得的增强型变体，进一步展示了通过定向优化分子伴侣活性实现精准治疗的可能性。