核磁共振（NMR）样品制备案例研究：自毁性蛋白酶caspase-6的相关考虑因素

《PLOS One》：An NMR sample preparation case study: Considerations for the self-destructive protease caspase-6

caspar-6结构解析与核磁共振样本制备优化。采用2x M9培养基提高大肠杆菌表达量，通过镍亲和色谱纯化结合梯度洗脱优化，使用PD-10脱盐柱进行缓冲交换，最终获得200 μM以上稳定浓度的 isotopic-labeled caspase-6，支持多维NMR动力学研究。研究为困难蛋白酶的NMR分析提供标准化制备流程。

　　在科学研究中，蛋白质的纯化和表征是一个极具挑战性的过程，尤其是对于那些具有高毒性、容易自裂解或在浓缩过程中容易聚集的蛋白。这类蛋白不仅难以获得足够的纯度和稳定性，而且在实验过程中容易发生结构变化，影响后续分析的准确性。Caspase-6（简称cas-6）作为一种在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶，其在神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病中的潜在作用使其成为药物研发的重要靶点。然而，由于其独特的结构特性以及在表达和纯化过程中的不稳定性，cas-6的NMR研究一直面临诸多困难。本文详细描述了研究团队为克服这些障碍而进行的一系列探索和优化工作，最终成功实现了cas-6的稳定表征，为类似蛋白质的NMR研究提供了重要的参考。

cas-6属于caspase家族，这一家族的蛋白酶在维持细胞稳态以及参与多种疾病的发生过程中扮演着重要角色。它们通常在底物蛋白的天冬氨酸残基之后进行切割，这一过程依赖于一个由半胱氨酸和组氨酸组成的催化二聚体。cas-6最初被称为哺乳动物CED-3同源物2（Mch2），是人类细胞死亡机制的同源物。随着研究的深入，caspase家族被进一步划分为不同的亚组，包括根据序列相似性、底物特异性以及其在凋亡级联反应中的作用。cas-6与caspase-3和caspase-7一起被归类为效应器或执行器caspase，因为它们在启动caspase激活后，参与执行程序性细胞死亡的关键步骤。

为了深入了解cas-6的结构及其在神经退行性疾病中的作用，研究团队已经采用了一些结构生物学技术，如X射线晶体学和氢-氘交换质谱（HDX-MS），揭示了cas-6的一些关键结构特征。然而，这些技术只能提供特定结构状态下的信息，而无法全面反映蛋白质在溶液中的动态行为。因此，研究团队决定采用核磁共振（NMR）技术，因为它能够提供基于氨基酸化学环境的残基特异性信息，这是其他技术所无法实现的。NMR特别适用于研究蛋白质的动态行为，例如结构转换和构象变化，这些是理解蛋白质功能和调控机制的重要方面。

然而，使用NMR对cas-6进行研究面临一个重大挑战，即如何获得足够浓度且稳定的蛋白质样品。传统上，cas-6在表达过程中表现出低产量，且容易在浓缩和缓冲液交换过程中发生聚集或沉淀。此外，当cas-6浓度较高时，其自毁特性会导致样品在实验过程中逐渐降解，这不仅影响NMR信号的强度，还可能导致实验结果的不准确。因此，研究团队需要优化整个样品制备流程，以确保获得足够浓度和稳定性的cas-6样品，使其能够适用于NMR实验。

为了实现这一目标，研究团队首先对cas-6的表达条件进行了优化。他们发现，在传统的丰富培养基（如2xYT）中，虽然能够获得一定量的蛋白，但其产量较低。相比之下，在更简单的M9最小培养基中，虽然资源有限，但可以提高蛋白的产量。此外，他们还发现，2x M9培养基相比普通的M9培养基，具有更高的缓冲容量，这使得在高细胞密度下诱导表达时，能够减少酸性副产物对蛋白的毒性影响，从而提高蛋白产量。最终，他们确定了在2x M9培养基中，将细胞培养至OD600为1.1，然后在20°C下诱导表达18小时，能够获得最佳的蛋白产量。

接下来，研究团队优化了蛋白纯化过程。传统的纯化方法通常包括镍亲和层析（Ni-affinity chromatography）和阴离子交换层析（anion-exchange chromatography）。然而，这些方法在处理cas-6时存在一些问题，例如在阴离子交换过程中，由于盐浓度的改变，可能导致蛋白在柱子上结合不充分，从而影响纯化效率。为了克服这一问题，研究团队对阴离子交换的洗脱条件进行了优化，采用了一种非线性梯度洗脱策略，即先进行线性梯度洗脱至150 mM NaCl，再进行一步骤至230 mM NaCl，这种方法显著提高了蛋白的洗脱浓度。此外，他们还发现，降低洗脱流速（从5 mL/min降至1 mL/min）有助于提高蛋白在洗脱液中的浓度，从而减少样品损失。通过这些优化，研究团队能够获得浓度达到约100 μM的cas-6样品，这为后续的缓冲液交换提供了足够基础。

缓冲液交换是NMR样品制备中的关键步骤，因为它能够确保蛋白在NMR实验中能够被分析，而不会受到缓冲液中氢原子信号的干扰。然而，传统的离心过滤法在处理cas-6时效果不佳，因为样品在浓缩过程中容易发生聚集或沉淀，导致回收率低于10%。相比之下，使用脱盐柱（如PD-10）进行缓冲液交换，能够实现更高的回收率，最高可达70%。研究团队发现，脱盐柱的大小、初始样品体积以及缓冲液的组成都会影响交换效率。例如，使用PD-10脱盐柱时，初始样品体积控制在合适的范围内，可以提高最终蛋白浓度，同时减少样品损失。此外，他们还发现，维持较高的pH值（如pH 8.5）和适当的还原剂（如DTT）浓度有助于保持cas-6的稳定性，从而减少在缓冲液交换过程中的损失。

在缓冲液交换过程中，研究团队还测试了不同缓冲液对cas-6活性的影响。他们发现，虽然在低pH条件下，如pH 7.5，能够提高某些NMR实验的信号强度，但同时也可能影响蛋白的活性。例如，在pH 7.5的缓冲液中，cas-6的VEIDase活性较低，这可能与其在较低pH下更容易发生结构变化有关。因此，研究团队最终选择了在pH 8.5下进行缓冲液交换，因为这一pH值能够平衡信号强度和蛋白活性，同时减少在交换过程中可能发生的结构变化。此外，使用适当的还原剂和甘油有助于维持蛋白的稳定性，从而提高NMR信号的质量。

为了进一步提高NMR信号的分辨率和强度，研究团队还测试了不同的蛋白标记方法。他们发现，使用甲基标记（如Ileδ1-13CH3）能够有效提高信号的稳定性，因为甲基氢原子不容易与缓冲液中的水分子发生交换，从而避免了信号的衰减。这种方法特别适用于研究cas-6的动态行为，因为它能够提供更清晰的信号，并且能够减少在高浓度下可能发生的蛋白聚集。此外，研究团队还发现，较高的盐浓度（如200 mM NaCl）有助于维持蛋白的折叠状态，同时不会显著影响信号强度。因此，他们选择了在200 mM NaCl的缓冲液中进行标记，以确保在NMR实验中获得高质量的信号。

在实验过程中，研究团队还注意到，某些添加剂如β-环糊精（BOG）虽然在某些情况下能够提高蛋白的溶解性，但对NMR信号的改善效果有限。因此，他们决定不使用这些添加剂，而是专注于优化缓冲液的组成和浓度。此外，他们还发现，使用不同的蛋白构型（如全长度的非活性cas-6 FL C163S和完全成熟的cas-6 D179 CT）对NMR信号的影响不同。全长度的cas-6 FL C163S虽然在某些情况下能够提供更清晰的信号，但其结构中包含较多的无序区域和可变连接区，这可能会影响信号的分辨率。相比之下，完全成熟的cas-6 D179 CT由于其结构更为紧凑，能够提供更清晰的甲基信号，这使其成为研究蛋白质核心区域动态变化的理想选择。

研究团队还对不同类型的NMR实验进行了评估，以确定最适合cas-6的实验条件。例如，他们发现，使用1D ¹H NMR谱能够有效评估蛋白的折叠状态，而使用2D ¹H-¹³C HMQC谱则能够提供更详细的残基特异性信息。为了确保实验的准确性，他们采用了多种NMR技术，包括优化的脉冲序列（如SOFAST）和适当的实验条件，以提高信号的强度和分辨率。此外，他们还对样品的稳定性进行了测试，发现经过优化后的cas-6样品在25°C下能够保持稳定至少五天，这为后续的NMR实验提供了足够的实验窗口。

总之，研究团队通过一系列系统的优化和实验，成功解决了cas-6在NMR研究中的主要挑战。他们不仅提高了cas-6的产量和纯度，还优化了缓冲液交换和标记方法，以确保在NMR实验中获得高质量的信号。这些优化措施包括使用2x M9最小培养基进行表达、优化镍亲和层析和脱盐柱的纯化步骤、选择适当的缓冲液条件（如pH 8.5和200 mM NaCl）以及采用甲基标记方法。这些方法的综合应用，使得cas-6的NMR研究成为可能，同时也为其他具有类似挑战的蛋白质研究提供了重要的参考。通过这一研究，科学家们能够更深入地了解cas-6的结构动态及其在神经退行性疾病中的作用，为未来的药物开发提供了坚实的理论基础和技术支持。