脑源性神经营养因子通过受体非依赖途径激活NRF2实现细胞保护：一种新型胞内信号传导机制

《Cell Reports》：BDNF exerts an NRF2-dependent cytoprotective function via a receptor-independent pathway

本研究揭示了脑源性神经营养因子（BDNF）通过其C末端细胞穿膜肽（CPP）序列直接跨膜进入细胞，与KEAP1蛋白结合并激活NRF2核转位，从而启动抗氧化应激的细胞保护通路。该机制独立于经典的TrkB/p75NTR受体途径，拓展了BDNF在细胞防御中的生物学功能，为氧化应激相关疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在生命活动中，细胞持续面临内源性代谢产物和外界环境因素（如活性氧，ROS）带来的氧化应激威胁。为了维持稳态，生物体演化出复杂的防御系统，其中KEAP1-NRF2通路作为核心的细胞保护机制，通过调控抗氧化酶和解毒基因的表达，抵御氧化损伤。传统观点认为，该通路主要受细胞内信号（如p62、p21蛋白）或小分子化合物（如萝卜硫素）激活。然而，是否存在一种细胞外蛋白质能直接调控这一系统，一直是未解之谜。

脑源性神经营养因子（BDNF）作为神经系统中重要的生长因子，已知通过结合TrkB和p75^NTR受体调控神经元存活、突触可塑性。近年研究发现，BDNF水平异常与抑郁症、神经退行性疾病中的氧化应激密切相关。例如，慢性压力导致海马BDNF下降时，伴随NRF2核转位受阻和抗氧化能力削弱。但BDNF如何影响NRF2的分子机制尚不明确，尤其是否依赖其受体信号途径存在争议。

为解决这一问题，Fath等人在《Cell Reports》发表的研究中，首次揭示了BDNF通过一种全新的受体非依赖途径直接激活KEAP1-NRF2通路。研究人员发现，BDNF的C末端隐藏着一个保守的细胞穿膜肽（CPP）序列，使其能像“特洛伊木马”一样自由穿越细胞膜。进入细胞后，BDNF与KEAP1蛋白高亲和力结合，解除其对NRF2的降解作用，促使NRF2入核启动抗氧化基因转录。这一机制在多种细胞（神经元、成纤维细胞、肠上皮细胞）和脑组织中均得到验证，且不依赖能量消耗或受体介导的内吞作用。

关键技术方法概述

研究综合运用分子生物学（基因敲除细胞构建、Western blot、免疫共沉淀）、生物物理学（表面等离子共振SPR分析结合亲和力）、影像学（共聚焦显微镜活细胞示踪）、生物信息学（分子对接模拟、系统进化分析）及功能实验（氧化应激模型下的细胞存活检测），在细胞系、原代神经元和大鼠海马体等多个层面验证了BDNF的穿膜能力及其与KEAP1的直接相互作用。

研究结果

1. 1.
   BDNF诱导NRF2核转位不依赖经典受体
   在HT-22海马细胞中，BDNF（1.85–37 nM）剂量依赖性地促进NRF2核转位，最大效应达对照的170%。即使使用p75^NTR阻断抗体或在不表达TrkB/p75^NTR的NIH 3T3细胞中，该效应依然存在。低温（4°C）条件下（抑制能量依赖的内吞和受体信号传导），BDNF仍能激活NRF2，证明其作用机制独立于受体功能。
2. 2.
   BDNF通过C末端CPP序列实现跨膜
   
   ELISA和放射性标记实验显示，BDNF能以浓度线性依赖的方式进入细胞，且过程不受低温或受体阻断影响。截除C末端25个氨基酸的BDNFΔC-ter丧失穿膜能力，但保留受体激活功能（如ERK磷酸化）。进一步实验证实，合成C末端肽段（C-ter BDNF）可携带膜不通透性 cargo（如TAMRA-荧光标记物）进入细胞，且其穿膜能力依赖于序列中精氨酸等正电荷氨基酸的保守性。系统进化分析表明，该CPP序列在颌口脊椎动物中长达4.5亿年高度保守，提示其生物学重要性。
3. 3.
   胞内BDNF直接结合KEAP1并破坏KEAP1-NRF2复合物
   免疫共沉淀和邻近连接实验（PLA）显示，BDNF与KEAP1在细胞内直接相互作用。表面等离子共振（SPR）测定二者结合解离常数K_D=2.71 nM，属于高亲和力结合。分子对接模拟提示BDNF通过疏水区域与KEAP1结合，而非模仿NRF2的ETGE motif。当BDNF与KEAP1预孵育后，NRF2的ETGE肽段与KEAP1的结合被抑制，说明BDNF通过竞争性结合KEAP1，释放NRF2并促进其核转位。
4. 4.
   BDNF通过NRF2依赖途径发挥细胞保护作用
   在叔丁基过氧化氢（tBHP）诱导的氧化应激模型中，预孵育BDNF可显著提升HT-22和NIH 3T3细胞的存活率，而BDNFΔC-ter或无活性的NRF2抑制剂ML385则取消该保护效应。RT-qPCR检测证实BDNF激活多个NRF2下游基因（如醌氧化还原酶NQO1、谷胱甘肽合成酶GCLC），增强细胞抗氧化能力。

结论与意义

本研究突破性地揭示了BDNF兼具“胞外信号分子”和“胞内调节蛋白”的双重角色：一方面通过受体依赖途径调控神经可塑性，另一方面通过CPP介导的穿膜作用直接激活KEAP1-NRF2系统，实现广谱的细胞保护。这种机制不仅解释了BDNF在无受体细胞中的生理功能，也为理解其在应激相关疾病（如抑郁症、神经退行性变、心肌梗死）中的作用提供了新视角。此外，研究在多种生长因子（如双调蛋白）中发现类似CPP序列，提示“受体非依赖的胞内信号传递”可能是蛋白质功能调控的普遍范式，为药物设计（如穿膜肽载体开发）和疾病治疗策略开辟了新方向。