DHX9 通过促进 STAT1 磷酸化来加剧癫痫发作，从而增加氧化应激和细胞凋亡

《Brain Research Bulletin》：DHX9 Aggravates Epilepsy by Promoting STAT1 Phosphorylation to Increase Oxidative Stress and Apoptosis

DHX9通过激活STAT1信号通路加剧癫痫相关神经元损伤。该研究构建了急性/慢性癫痫小鼠模型及体外细胞模型，发现DHX9在癫痫模型中显著上调，并通过直接相互作用促进STAT1磷酸化，进而激活氧化应激和凋亡通路，加重神经元损伤。机制验证显示，STAT1特异性抑制剂可逆转DHX9过表达引起的神经毒性，证实STAT1是DHX9介导癫痫病理的关键下游分子。研究首次揭示了RNA解旋酶DHX9在癫痫中的致病机制，为开发靶向DHX9-STAT1轴的新疗法提供了理论依据。

　　### DHX9与癫痫发病机制及STAT1相互作用的研究

在神经科学领域，癫痫是一种复杂的神经系统疾病，具有全球高达1%的患病率，严重威胁患者的生活质量和社交功能。这种疾病的主要特征是大脑中异常的神经元放电导致反复的癫痫发作，同时伴随多种病理过程，如神经元损伤、炎症反应和氧化应激等。尽管已有多种抗癫痫药物可供选择，但仍有约30%的患者对现有治疗方案产生耐药性，这表明有必要深入研究癫痫的分子发病机制，以探索新的治疗策略。

RNA解旋酶在细胞内RNA代谢和基因表达调控中发挥着关键作用。其中，DEAH-box解旋酶9（DHX9）作为RNA解旋酶超家族的重要成员，具有多种生物学功能，包括RNA剪接、转录调控、翻译起始和DNA损伤修复。DHX9在细胞核和细胞质中均存在，能够解开RNA的二级结构，并参与前mRNA剪接和翻译调控。近年来的研究表明，DHX9在多种疾病中发挥重要作用，包括癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病。然而，DHX9在癫痫发病机制中的具体作用及其调控机制尚不清楚。

信号转导和转录激活因子1（STAT1）是JAK-STAT信号通路的核心成分，对细胞增殖、分化、凋亡和免疫反应具有重要的调控作用。STAT1在被上游激酶磷酸化后，能够形成同源或异源二聚体，进入细胞核，结合特定的DNA序列，从而调控下游靶基因的转录。在神经系统中，STAT1信号通路与炎症反应、氧化应激和神经元凋亡密切相关。已有研究表明，STAT1的异常激活与多种神经系统疾病的发生和发展有关，如阿尔茨海默病、帕金森病和脑卒中。此外，新兴的证据表明，RNA解旋酶与STAT信号通路之间可能存在交叉调控关系。因此，我们假设DHX9可能通过与STAT1的相互作用来调控癫痫的发病过程。

氧化应激是由于细胞内活性氧（ROS）的产生与抗氧化防御系统之间的失衡导致的，它在癫痫的发病机制中起着重要作用。过量的ROS会损害细胞膜、蛋白质和DNA，导致神经元功能障碍和凋亡。在癫痫发作过程中，异常的神经元放电会大量消耗ATP，破坏细胞内钙稳态，激活多种氧化酶系统，从而引发大量ROS的产生。同时，抗氧化酶活性的降低进一步加剧了氧化应激的状态。丙二醛（MDA）作为脂质过氧化的终产物，是评估氧化应激水平的重要指标。因此，理解DHX9在癫痫中对氧化应激的调控机制对于开发新的抗氧化治疗策略具有重要意义。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对维持组织稳态和清除受损细胞具有重要作用。然而，在病理状态下，过量的神经元凋亡会导致神经功能障碍和疾病进展。癫痫发作会触发多种凋亡信号通路，包括线粒体介导的内在通路和死亡受体介导的外在通路。炎症因子如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在癫痫相关的神经炎症和凋亡中发挥重要作用。这些促炎因子不仅直接诱导神经元凋亡，还通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞，加剧神经炎症反应。

尽管已有研究在理解癫痫的发病机制方面取得了显著进展，但DHX9在癫痫中的具体作用及其与STAT1信号通路的相互作用机制仍不清楚。特别是DHX9如何调控STAT1的磷酸化，以及这种调控如何影响氧化应激和凋亡等下游过程，需要进一步深入研究。此外，DHX9是否可以作为癫痫治疗的潜在靶点也尚待探索。本研究旨在探讨DHX9在癫痫发病机制中的作用及其分子机制，我们假设DHX9通过直接与STAT1相互作用，促进其磷酸化，从而激活下游的氧化应激和凋亡信号通路，最终加剧癫痫的病理过程。通过生物信息学分析、动物实验、细胞实验和分子生物学技术，我们将系统地验证这一假设，并阐明DHX9-STAT1信号轴在癫痫中的作用机制。

### 方法

#### 2.1 生物信息学分析方法

本研究采用GSE224944数据集，该数据集来源于GEO数据库。该数据集包含3个正常对照样本和6个KA诱导的癫痫模型样本的RNA-Seq表达数据。我们对这些数据进行了主成分分析（PCA），以区分癫痫模型组和对照组样本，从而识别两组之间的基因表达差异。此外，我们通过Genedenovo生物数据库网站进行了聚类分析和火山图分析，以进一步验证DHX9在癫痫模型中的表达变化。所有数据均在线获取，并通过Genedenovo生物数据库网站进行了背景校正、标准化和对数转换等数据处理。

#### 2.2 基因集富集分析（GSEA）

GSEA通过比较样本的基因表达数据与特定基因集的富集程度，评估基因集在样本中的相对富集情况。我们选择了来自分子特征数据库MSigDB的Hallmark基因集和KEGG基因集，以分析GSE224494数据集中与癫痫相关的基因集富集情况。通过GSEA算法计算了每个样本和基因的富集分数，用于比较正常组织与癫痫组织之间的功能差异。

#### 2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）

我们使用String数据库的共表达模块构建基因共表达网络图，并通过Cytoscape进行处理和美化。这一分析方法有助于识别DHX9与其他蛋白之间的潜在相互作用，为后续实验提供理论依据。

#### 2.4 动物模型建立

本研究采用60只小鼠作为实验对象，体重为20-22克，饲养在环境温度（22±2）℃、湿度50%-60%、12小时/12小时光照/黑暗周期的环境中，自由获取食物和水。所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》，并获得天津医学生物实验动物伦理审查委员会的批准（协议编号YSY-DWLL-2024515）。小鼠被随机分为对照组和KA组（每组6只）。为了诱导癫痫模型，小鼠接受单次腹腔注射KA（20毫克/千克体重）。KA被新鲜溶解于无菌0.9%生理盐水中，浓度为2毫克/毫升，注射体积根据小鼠体重调整（约200-250微升/只）。对照组小鼠接受等体积的无菌生理盐水注射。PTZ由MCE公司提供，用于建立PTZ诱导的癫痫模型。PTZ组小鼠接受腹腔注射PTZ（50毫克/千克），而对照组小鼠接受等剂量的正常生理盐水。小鼠的癫痫发作情况根据Racine评分标准进行观察和分级。Racine分级标准包括：I级：咀嚼、胡须震颤、面部抽搐；II级：颈部抽搐、头部点头；III级：单侧前肢抽搐、背部拱起、尾巴竖立；IV级：双侧前肢抽搐和后肢站立或平衡丧失后立即恢复；V级：站立和跌倒伴有抽搐，可能伴随死亡。达到IV级或以上且未死亡的小鼠被认为是成功的急性癫痫模型。我们通过颅内立体定位注射AAV载体，以研究DHX9在癫痫中的作用。AAV载体使用pAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP骨架构建，DHX9靶向shRNA序列为5’-ccggCGCAAAGTGTTTGATCCAGTActcgagTACTGGATCAAACACTTTGCGtttttg-3’。选择AAV2/9血清型以获得最佳的神经元转导效率。病毒载体通过qPCR滴度法生产并纯化，最终滴度为1×10^12病毒基因组/毫升。对于AAV载体的颅内立体定位注射，小鼠被麻醉后，使用前囟作为定位基准。前囟和后囟位于同一水平，两者之间距离约为0-0.1毫米。前囟作为“0点”，前囟向口的方向为“+”，向尾的方向为“-”。小鼠头部被固定在立体定位装置中，头部毛发被剃除并消毒，沿矢状缝做3厘米切口，缓慢分离皮下组织以暴露前囟、人字缝和矢状缝。在人字缝上方放置金属定位针，确定前囟的标准中线后，在前囟后方2毫米和矢状缝外侧2.5毫米的位置进行定位，这对应于海马区域的位置。钻孔后，将1微升AAV溶液注入每侧海马，深度为2毫米，而对照组则接受等体积的生理盐水。皮下组织和头皮被缝合，组织对齐，切口用酒精消毒。治疗后一周，小鼠接受qRT-PCR和Western blot检测目标蛋白表达，以验证AAV转染效率。

#### 2.5 细胞培养与处理

HT22神经元细胞和BV2小胶质细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养温度为37℃，培养箱中CO?浓度为5%。细胞状态良好时，将其接种在25厘米2的培养皿中，当细胞融合度达到80%-90%时，按照转染协议进行转染。细胞被分为对照组（空载体）和实验组（OE-DHX9），每组使用4微克/毫升的polybrene，浓度为1:1000。转染后12小时更换为正常培养基，并在第二天重复一次转染，总共进行四次转染。转染完成后，加入0.5微克/毫升的puromycin（Sigma-Aldrich，美国）以选择阳性克隆，持续超过3天。每天更换培养基，并观察和移除死亡细胞。细胞融合后，将其冷冻保存（P0代）并传代。P2代细胞用于评估转染效率。

#### 2.6 谷氨酸刺激细胞模型

当HT22神经元细胞融合度达到80%-90%时，分别用0毫摩尔、5毫摩尔和10毫摩尔的谷氨酸进行处理。在浓度梯度实验中，细胞在不同谷氨酸浓度处理后24小时收集。在时间动力学实验中，细胞分别用5毫摩尔谷氨酸处理0小时、12小时和24小时，并在处理后收集细胞以检测DHX9表达变化。

#### 2.7 乙酰胆碱（KA）刺激细胞模型

当HT22神经元细胞融合度达到适当水平时，用100微摩尔的KA进行处理。KA储备液（10毫摩尔）用无菌蒸馏水制备，分装并保存于-20℃。工作浓度在使用前新鲜稀释至培养基中。细胞在处理后0小时、12小时和24小时收集，以检测时间依赖的DHX9 mRNA表达变化。

#### 2.8 内毒素（LPS）刺激细胞模型

当BV2小胶质细胞融合度达到适当水平时，用1微克/毫升的LPS进行处理。细胞在处理后0小时、12小时和24小时收集，以检测时间依赖的DHX9 mRNA表达变化，其中24小时时表达达到高峰。

#### 2.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

取50毫克小鼠海马组织，用TRNzol试剂提取RNA。将1微升RNA溶解于99微升RNase-free水中，用紫外分光光度计测量260纳米和280纳米波长的光吸收值，以确定RNA浓度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO公司，日本）按照制造商的协议进行cDNA合成。DHX9的完整基因序列从PubMed GeneBank获取，并由上海Invitrogen生物科技公司设计和合成。β-actin序列从相关数据库获取并验证。DHX9引物：正向：5’-CCCCCACCTGTTGATCCTTC-3’，反向：5’-GACCAAGGAACCACTCCCAC-3’；IL-6引物：正向：5’-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3’，反向：5’-GGTCTGTTGGGAGTGGTATC-3’；TNFα引物：正向：5’-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3’，反向：5’-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3’；β-actin引物：正向：5’-GGTATGGAATCCTGTCGCATCCATGAAA-3’，反向：5’-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’。β-actin作为内参。使用实时PCR系统（Applied Biosystems 7500或等效设备）进行qRT-PCR，采用SYBR Green Master Mix。反应条件为：95℃下10分钟，随后进行40个循环，每次循环包括95℃下15秒和60℃下1分钟。相对表达水平通过2^(-ΔΔCt)方法计算。

#### 2.10 蛋白质印迹（Western Blot）

使用Western blot检测相关蛋白的表达水平。小鼠脑组织在低温条件下收集，称重后在液氮中均质化。使用RIPA缓冲液（150毫摩尔NaCl，1.0% NP-40，0.5%十二烷基硫酸钠，0.1% SDS，50毫摩尔Tris-HCl pH 8.0）进行组织裂解，加入蛋白酶抑制剂混合物在4℃下孵育30分钟，随后在4℃下12,000转/分钟、10分钟的离心后收集上清液。使用BCA方法（Cat. No. 23227，Pierce/Thermo Fisher Scientific，美国）测定脑组织中的蛋白含量。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质转移到PVDF膜（Millipore）上，使用湿转系统在冰浴中进行2小时的转移，电压为100伏。膜用TBST洗涤三次。在37℃下使用温和摇床进行封闭1小时。洗涤后，加入一抗，孵育过夜。一抗包括抗DHX9（1:1000，DF12266，Affinity Biosciences，江苏，中国）、抗β-actin（1:5000，AF7018，Affinity Biosciences，江苏，中国）、抗磷酸化STAT1（S727）（1:1000，ab109461，Abcam，美国）和抗STAT1（1:1000，ab234400，Abcam，美国）。洗涤后，加入二抗，孵育37℃下1小时，随后用TBST洗涤三次。最后，使用ECL化学发光法进行显影和拍照，β-actin作为内参。使用ImageJ软件分析和计算目标蛋白和β-actin的相对表达水平。

#### 2.11 免疫共沉淀（Co-IP）

使用Pierce HA-Tag IP/Co-IP试剂盒（Cat. No. 26180，Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商的说明进行实验。从HT22细胞中提取蛋白后，将其分为正向和反向共沉淀组。细胞裂解液与1微克的DHX9抗体和STAT1抗体分别孵育，使用温和摇床在4℃下孵育过夜。加入预处理的10微升HA琼脂糖珠，随后在4℃下孵育2-4小时以允许抗体与HA琼脂糖珠结合。共沉淀后，将样品在4℃下12,000转/分钟、30秒的离心后收集琼脂糖珠。小心移除上清液，并用1毫升裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠3-4次。最后，加入15-20微升1× SDS上样缓冲液，将样品在100℃下煮沸5分钟。样品进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并随后进行Western blot分析。

#### 2.12 免疫荧光染色

将脑组织固定于4%多聚甲醛中，脱水并包埋于石蜡中。切片（5微米厚）进行脱蜡、水化和柠檬酸缓冲液（pH 6.0）抗原修复。使用5%正常山羊血清在室温下封闭1小时。切片在4℃下与一抗孵育过夜，包括抗DHX9（1:200）、抗NeuN（1:200，ab177487，Abcam，美国）、抗GFAP（1:200，ab7260，Abcam，美国）和抗IBA1（1:200，ab178846，Abcam，美国）。洗涤后，切片与荧光二抗（1:500）在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI进行复染。使用荧光显微镜拍摄图像，并使用ImageJ软件分析荧光强度。每只动物分析至少5个切片，并计算每个切片的平均荧光强度。

#### 2.13 尼氏染色

将脑组织取出，固定于40克/升的多聚甲醛（Cat. No. P6148，Sigma-Aldrich，美国）中，在4℃下固定72小时。组织块在蜡中脱水23小时，然后包埋于石蜡中。使用石蜡切片机（Leica RM2016）切割5微米厚的冠状切片。切片在40℃下展开于蒸馏水中，然后收集在100克/升的聚赖氨酸（Cat. No. P8920，Sigma-Aldrich，美国）涂层的载玻片上，干燥后在46℃下烘焙2小时保存。常规脱蜡后，切片用10克/升的甲基蓝溶液（Cat. No. G1036-100ML，ServiceBio，中国）进行染色6分钟，用蒸馏水冲洗5分钟以去除背景染色，然后依次放置于700毫升/升乙醇中2分钟、50毫升/升乙醇中5分钟和绝对乙醇中3分钟。切片在二甲苯中澄清两次，每次5分钟，然后用中性树胶封片。每只小鼠观察两个随机选择的尼氏染色脑切片，使用200倍放大倍率观察海马神经元的尼氏体染色情况，并在每组脑切片的相同海马区域使用400倍放大倍率进行神经元计数。

#### 2.14 EdU掺入实验检测细胞增殖

每组转染的HT22细胞被收集，并在良好生长状态下用胰蛋白酶消化。细胞以每孔3×10?个细胞的密度接种于24孔板中，并在细胞附着后培养一夜。第二天，根据试剂盒说明，向每孔加入400微升稀释的EdU工作液（最终浓度为10微摩尔，由Click-iT EdU试剂盒制备）。在37℃、5% CO?条件下孵育2小时。移除细胞培养基，进行细胞固定、通透、EdU反应和核染色。每一步后使用3% BSA洗涤三次，每次5分钟。最后，使用荧光显微镜观察EdU标记和未标记的细胞，拍照并计数。

#### 2.15 TUNEL染色检测HT22细胞凋亡

使用TUNEL检测试剂盒（Cat. No. 25879，Cell Signaling Technology，美国）按照制造商的说明进行实验。细胞用40毫升/升甲醛固定，然后用1毫升/升Triton X-100通透，与TUNEL反应混合物孵育1小时。细胞核用DAPI（1微克/毫升，Cat. No. D9542，Sigma-Aldrich，美国）染色。使用共聚焦荧光显微镜检测凋亡细胞，激发波长为488纳米，发射波长为530纳米（TUNEL）和358纳米、461纳米（DAPI）。每份样本选择四个随机视野（×200）进行凋亡细胞计数。凋亡细胞百分比 = TUNEL阳性细胞数（绿色荧光）/总细胞数（蓝色荧光）× 100%。

#### 2.16 DCFH-DA荧光探针检测ROS生成

使用DCFDA/H2DCFDA细胞ROS检测试剂盒（Cat. No. ab113851，Abcam，英国）进行ROS生成检测。每组的原始培养基被吸出并丢弃，细胞用PBS溶液洗涤，然后加入预热的DCFH-DA ROS染色溶液。细胞在37℃、5% CO?、黑暗条件下孵育20分钟。孵育后，用PBS洗涤两次（以去除未进入细胞的DCFH-DA）。使用倒置荧光显微镜观察细胞内的ROS水平，激发波长为485纳米，发射波长为530纳米，并从每份样本中收集五个随机视野的图像。使用ImageJ软件量化荧光强度。

#### 2.17 铁离子含量检测

细胞被收集并接种于6孔板中，然后根据分组进行处理。移除培养基，细胞用PBS洗涤，离心并重悬于100微升PBS中。使用铁离子检测试剂盒（Colorimetric，Cat. No. ab83366，Abcam，英国）检测总细胞内铁离子含量。Fe2?检测步骤：向每孔加入5微升缓冲液（37℃）并孵育30分钟，然后加入100微升铁离子探针并在黑暗条件下孵育1小时（37℃）。最后，使用微板读数仪在593纳米波长下测量吸光度。Fe2?含量根据标准曲线计算。

#### 2.18 ELISA检测TNF-α、IL-6和LDH表达水平

每组小鼠的脑组织被用适当量的生理盐水均质化，离心10分钟（3000转/分钟，离心半径10厘米），收集上清液作为测试样本。根据试剂盒说明，标准品进行梯度稀释，每孔加入50微升测试样本。在Excel工作表中，标准品浓度作为x轴，对应的OD值作为y轴，生成标准线性回归曲线。样本浓度值根据曲线方程计算。

#### 2.19 统计分析

使用SPSS 19.0（IBM Corporation，纽约，美国）进行统计处理。定量数据以均值±标准差表示。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验。所有统计检验为双尾检验，P < 0.05认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。

### 结果

#### 3.1 DHX9在PTZ诱导的急性及慢性癫痫小鼠和KA诱导的癫痫小鼠海马组织中表达上调

生物信息学分析结果表明，主成分分析有效区分了癫痫模型组和对照组样本，显示两组之间的基因表达差异（图1A）。聚类分析进一步确认了癫痫模型组和对照组样本的明显分离，验证了实验分组的有效性（图1B）。火山图分析清晰地显示，在癫痫诱导模型中DHX9表达上调，具有统计学意义（图1C）。我们对GSE224494数据集进行了基因集富集分析（GSEA），以识别KA诱导的癫痫模型中失调的关键生物通路。如图S2所示，差异表达基因显著富集在与癫痫发生密切相关的几个通路中，包括：（1）HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB，突出炎症反应的重要性；（2）HALLMARK_APOPTOSIS，表明细胞死亡通路被激活；（3）GOBP_NEURON_PROJECTION_EXTENSION，显示神经元结构可塑性的改变；以及（4）DESCARTES_ORGANOGENESIS_CHOLINERGIC_NEURONS，反映神经元发育和分化过程。这些富集结果表明，癫痫模型在炎症、细胞死亡和神经元功能方面表现出协调的变化，这些都是癫痫发生的关键病理特征。DHX9作为RNA解旋酶，在细胞应激反应和RNA代谢中具有功能联系，这些过程是我们在GSEA分析中识别出的炎症和细胞死亡通路的上游调控因子。为了验证生物信息学分析结果，我们使用三种不同的癫痫动物模型检测DHX9的mRNA表达水平。在PTZ诱导的急性癫痫小鼠模型中，海马组织中的DHX9 mRNA表达量高于对照组（图1D）。同样，在PTZ诱导的慢性癫痫小鼠模型中，DHX9 mRNA表达也呈现上调（图1E）。为了研究DHX9在癫痫发病机制中的作用，我们建立了KA诱导的急性癫痫小鼠模型。在腹腔注射KA（20毫克/千克）后，小鼠表现出典型的癫痫行为，符合成功的癫痫诱导（Racine评分等级3-5）。在KA给药后24小时，收集海马组织进行后续分析。此外，在KA诱导的癫痫模型中，我们观察到DHX9 mRNA表达增加，与前两种模型结果一致（图1F）。这些结果表明，DHX9表达在急性及慢性癫痫模型中均呈现上调趋势。为了进一步评估癫痫模型的病理特征，我们进行了多种神经标志物的免疫荧光染色分析。NeuN免疫荧光染色结果显示，癫痫模型组中NeuN阳性神经元的荧光强度降低，表明癫痫诱导导致显著的神经元丢失或损伤（图1G）。相反，GFAP免疫荧光染色显示，癫痫模型组中星形胶质细胞的GFAP表达增强，反映反应性星形胶质细胞增殖的激活（图1H）。IBA1免疫荧光染色结果显示，癫痫模型组中微胶质细胞的IBA1表达显著上调，表明微胶质细胞激活和神经炎症反应（图1I）。尼氏染色进一步确认了癫痫模型中神经元数量的减少。癫痫模型组脑组织中尼氏染色阳性神经元的数量显著减少，与NeuN免疫荧光结果一致，共同确认了癫痫引起的神经元丢失（图S1）。为了进一步验证癫痫脑组织中DHX9的上调，我们进行了海马切片的免疫荧光染色。免疫荧光染色显示，与对照组相比，KA处理小鼠的海马区域中DHX9表达增加（图1J），尽管本研究未确定DHX9的具体表达细胞类型。

#### 3.2 DHX9表达在癫痫相关病理过程中增加

为了验证DHX9在癫痫相关病理过程中的表达调控，我们建立了多种体外细胞模型。在HT22神经元细胞中，谷氨酸处理诱导了DHX9表达的浓度依赖性上调，随着谷氨酸浓度从0毫摩尔增加到5毫摩尔和10毫摩尔，DHX9表达水平逐渐升高（图2A）。时间动力学分析显示，在5毫摩尔谷氨酸处理后，DHX9表达表现出时间依赖性上调，在0小时、12小时和24小时时间点均呈现上升趋势（图2B）。同样，在100微摩尔KA处理的HT22细胞中，DHX9表达也表现出时间依赖性上调，表达水平在0小时、12小时和24小时时间点逐渐增加（图2C）。在BV2小胶质细胞中，1微克/毫升LPS处理诱导了DHX9在mRNA和蛋白水平上的时间依赖性上调，表达水平在处理后0小时、12小时和24小时逐渐增加，达到峰值（图2D）。这些结果表明，DHX9在各种癫痫相关病理刺激下表达上调，包括兴奋毒性反应和神经炎症反应，与体内癫痫模型结果一致，确认了DHX9在癫痫发病机制中的重要作用。

#### 3.3 DHX9过表达加重神经元损伤

为了验证DHX9在神经元损伤中的功能作用，我们构建了DHX9过表达载体并转染HT22细胞。qPCR和Western blot结果确认，与阴性对照组（OE-NC）相比，DHX9过表达组（OE-DHX9）的DHX9 mRNA和蛋白表达均上调，其中蛋白表达增加约3倍，确认了过表达载体的有效性（图3A-B）。功能研究表明，DHX9过表达加重了谷氨酸诱导的神经元损伤。炎症因子分析显示，与谷氨酸处理组和谷氨酸+OE-NC组相比，谷氨酸+OE-DHX9组的IL-6和TNF-α水平进一步升高（图3C-D）。细胞损伤标志物LDH释放同样呈现出这一趋势，DHX9过表达组的LDH释放水平最高（图3E）。氧化应激分析显示，DHX9过表达加剧了谷氨酸诱导的氧化损伤。铁离子含量和ROS水平在谷氨酸+OE-DHX9组中达到最高，超过了单独谷氨酸处理组的水平（图3F-G）。细胞命运分析进一步确认了DHX9的有害作用。TUNEL染色显示，DHX9过表达增加了谷氨酸诱导的细胞凋亡，谷氨酸+OE-DHX9组的凋亡细胞数最高（图3H）。相反，EdU掺入实验显示，DHX9过表达进一步抑制了细胞增殖，谷氨酸+OE-DHX9组的增殖细胞数降至最低（图3I）。这些结果确认了DHX9过表达加重谷氨酸诱导的神经元损伤，表现为增强的炎症反应、加剧的氧化应激、增加的细胞凋亡和降低的增殖能力。

#### 3.4 DHX9沉默减少KA诱导小鼠中的癫痫神经元损伤

为了进一步验证DHX9在癫痫中的功能作用，我们采用功能丧失研究策略，使用shRNA沉默DHX9表达并评估其对KA诱导癫痫的影响。首先，我们验证了沉默效率。qPCR结果显示，与对照组（Scr）相比，DHX9沉默组（sh-DHX9）的DHX9 mRNA表达下调（图4A）。Western blot分析确认，DHX9沉默组的DHX9蛋白表达比对照组减少了约70%，确认了基因沉默的有效性（图4B）。免疫荧光染色进一步验证了DHX9的成功沉默，显示sh-DHX9组的DHX9荧光信号显著弱于对照组（图4C）。行为分析显示，DHX9沉默改善了KA诱导的癫痫表型。癫痫潜伏期分析显示，Scr+Veh组和sh-DHX9+Veh组均未表现出癫痫发作，两组的潜伏期相似；Scr+KA组表现出最短的癫痫潜伏期，而sh-DHX9+KA组的潜伏期延长，表明DHX9沉默可以延迟癫痫发作（图4D）。最大癫痫等级分析显示，DHX9沉默减少了KA诱导癫痫的严重程度，sh-DHX9+KA组的最大癫痫等级显著低于Scr+KA组（图4E）。癫痫持续时间和癫痫频率分析进一步确认了DHX9沉默的保护作用，显示sh-DHX9+KA组的癫痫持续时间和频率均低于Scr+KA组（图4F-G）。神经病理分析显示，DHX9沉默减少了KA诱导的神经元损伤。NeuN免疫染色显示，Scr+Veh组和sh-DHX9+Veh组的神经元密度相似且维持在正常水平；Scr+KA组表现出明显的神经元丢失，NeuN阳性细胞减少；而sh-DHX9+KA组的神经元保存情况显著优于Scr+KA组，表明DHX9沉默具有神经保护作用（图4H）。反应性胶质细胞激活分析显示，DHX9沉默可以减少KA诱导的神经炎症反应。GFAP免疫染色显示，Scr+KA组表现出明显的星形胶质细胞激活，GFAP表达增加；而sh-DHX9+KA组的GFAP表达水平显著低于Scr+KA组，表明DHX9沉默可以抑制反应性星形胶质细胞增殖（图4I）。同样，IBA1免疫染色显示，DHX9沉默减少了KA诱导的小胶质细胞激活，sh-DHX9+KA组的IBA1表达水平显著低于Scr+KA组（图4J）。这些结果确认了DHX9沉默改善KA诱导的癫痫表型。

#### 3.5 DHX9沉默通过抑制STAT1通路减少癫痫小鼠的神经元损伤

为了探讨DHX9作用的分子机制，我们对KA诱导的癫痫模型小鼠的脑组织进行了转录组测序分析。基因集富集分析（GSEA）显示，癫痫样本中与STAT家族蛋白结合相关的基因显著富集。富集图显示，与STAT家族蛋白结合相关的基因在癫痫模型中优先上调，如图5A和图S2所示，富集得分（ES）为0.66，标准化富集得分（NES）为1.90。这些结果表明，STAT1信号通路可能是DHX9介导癫痫相关神经元损伤的关键下游通路。基于这一发现，我们进一步评估了DHX9沉默对癫痫相关病理过程的影响。氧化应激分析显示，DHX9沉默减少了KA诱导的氧化损伤。MDA含量检测显示，Scr+Veh组和sh-DHX9+Veh组的MDA含量保持正常水平，而Scr+KA组的MDA含量升高，sh-DHX9+KA组的MDA含量显著低于Scr+KA组（图5B）。ROS水平的变化与MDA一致，DHX9沉默减少了KA诱导的ROS生成，sh-DHX9+KA组的ROS水平显著低于Scr+KA组（图5C）。炎症反应分析显示，DHX9沉默可以抑制KA诱导的神经炎症。IL-6含量检测显示，Scr+KA组的IL-6水平升高，而sh-DHX9+KA组的IL-6水平显著低于Scr+KA组，表明DHX9沉默具有抗炎作用（图5D）。尼氏染色结果进一步确认了DHX9沉默的神经保护作用。Scr+Veh组和sh-DHX9+Veh组的神经元密度相似且维持在正常水平；Scr+KA组表现出明显的神经元丢失，尼氏阳性细胞数减少；而sh-DHX9+KA组的神经元保存情况显著优于Scr+KA组，尼氏阳性细胞数高于Scr+KA组（图5E）。在基因列表的早期排名部分中，基因集成员（黑条）的浓度与癫痫表型呈正相关（热图中红色表示正相关，蓝色表示负相关），表明在癫痫发生过程中，STAT相关结合过程存在协调上调。关键分子机制分析显示，DHX9通过抑制STAT1磷酸化来发挥保护作用。Western blot结果显示，Scr+Veh组和sh-DHX9+Veh组的p-STAT1水平保持在基线水平，而总STAT1蛋白在各组之间无显著差异。Scr+KA组的p-STAT1水平比对照组增加了约4倍，表明KA处理激活了STAT1磷酸化。重要的是，sh-DHX9+KA组的p-STAT1水平比Scr+KA组减少了约50%，表明DHX9沉默可以抑制KA诱导的STAT1磷酸化（图5F）。这些结果表明，DHX9沉默通过抑制STAT1磷酸化减少了KA诱导的氧化应激、炎症反应和神经元损伤，确认了DHX9-STAT1信号轴在癫痫发病机制中的关键作用。

#### 3.6 DHX9和STAT1通过蛋白质-蛋白质相互作用直接结合

为了阐明DHX9如何发挥其作用的分子基础，我们研究了DHX9与STAT1之间是否存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用。首先，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析预测了DHX9与STAT