对表达L-Myc的神经干细胞及其细胞外囊泡进行单细胞分析，揭示了具有神经发生潜能的不同前体细胞群体

《Journal of Extracellular Biology》：Single-Cell Analysis of L-Myc Expressing Neural Stem Cells and Their Extracellular Vesicles Revealed Distinct Progenitor Populations With Neurogenic Potential

神经干细胞（NSC）来源的外泌体（EVs）在修复脑损伤中具有潜力。研究重点分析了两种人胎儿NSC系（LMNSC01和LMNSC02）及其外泌体的分子特征和功能。通过单细胞RNA测序、质谱分析及外泌体纳米成像技术，发现两者EVs在蛋白质组成（如细胞粘附、迁移相关蛋白）和尺寸（LMNSC02-EVs平均直径更大）上存在差异。功能实验显示，这些EVs能显著缓解甲氨蝶呤（MTX）诱导的脑毒性，恢复神经元和胶质细胞，但对 oligodendrocyte progenitor cells（OPCs）效果有限。研究揭示了NSC-EVs的异质性及其靶向神经修复的分子机制。

　　神经干细胞（NSC）在促进脑修复方面展现出巨大的潜力。它们可以通过释放神经营养因子、支持细胞替换以及刺激内源性神经发生来改善受损脑组织的恢复。尽管已有大量研究揭示了NSC及其外泌体（EVs）在保护和再生方面的潜力，但将这些疗法转化为临床应用仍面临挑战，主要体现在对NSC系及其EV内容物的分子特征研究尚不充分。为了解决这一问题，本研究对两种具有治疗价值的人类胎儿NSC系LMNSC01和LMNSC02进行了全面的分子特征分析，以及它们所分泌的EVs的特性研究。这两个NSC系均经过基因工程改造以表达L-MYC基因，具有良好的自我更新能力和分化潜力。LMNSC01细胞主要分化为神经元，而LMNSC02细胞则能分化为神经、胶质和少突胶质前体细胞（OPCs）三种主要神经谱系。单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，这两种NSC系在转录谱系上表现出显著的差异，重叠程度较低。通过单个外泌体纳米显微镜技术（SEVEN），我们发现两者均主要释放圆形EVs，但LMNSC02-EVs在四跨膜蛋白（如CD9、CD63和CD81）的表达水平和平均直径方面高于LMNSC01-EVs。蛋白质组学分析进一步揭示，LMNSC01-EVs富含与细胞黏附、迁移、连接形成和神经突触发育相关的蛋白质，而LMNSC02-EVs则富含与细胞质翻译起始和生物合成相关的分子。这些EVs（从未分化的LMNSC中收集）在甲氨蝶呤（MTX）诱导的脑类器官模型中展现出神经保护作用，能够恢复神经元和星形胶质细胞的数量，但未能挽救OPCs。这些发现表明，LMNSC来源的EVs在对抗化疗诱导的神经毒性方面具有治疗潜力，尤其在维持神经元和星形胶质细胞方面表现出显著效果。然而，恢复少突胶质细胞群体可能需要重复或补充的干预措施。

本研究采用多种先进技术对LMNSC细胞系及其EVs进行了全面的表征，包括单细胞转录组学、蛋白质组学和成像技术。这些方法为我们提供了关于LMNSC和其分泌EVs的分子组成和生物学功能的详细信息，支持其在中枢神经系统（CNS）疾病中的临床应用潜力。研究还通过一个MTX诱导的脑类器官模型，评估了LMNSC-EVs的神经保护特性。该模型与“化疗脑”（chemobrain）的已知病因相吻合，因为MTX会导致小胶质细胞激活、少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的破坏，以及白质损伤，这些因素共同导致三胶质功能障碍。结果显示，LMNSC-EVs能够有效恢复神经元和星形胶质细胞的数量，但对少突胶质细胞的修复作用有限，这可能反映了少突胶质细胞对MTX的高度敏感性。因此，对于该细胞谱系的修复可能需要更长时间的孵育或多次EV治疗。

在方法部分，我们详细描述了LMNSC01和LMNSC02细胞的培养、分化和EV提取过程。细胞在特定的培养基中生长，其中包含基本成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和肝素等成分。为了维持生理性的低氧环境，细胞在4%氧气条件下培养，以防止氧化应激和突变积累。EV的提取采用了多种方法，包括使用Izon-qEV柱进行尺寸排除色谱法（SEC），以及通过离心和浓缩步骤进行初步处理。通过纳米粒子追踪分析（NTA）和荧光显微镜观察，我们确认了EV的浓度、大小分布及其形态特征。RNA的提取和纯化则通过MiRNeasy Serum/Plasma Kit进行，并结合了DNase处理以去除DNA污染。为了进一步分析EV的RNA内容物，我们采用了Illumina的RNA-seq技术，获得了详细的转录组数据。

在蛋白质组学分析中，我们利用数据独立分析质谱（DIA-MS）对LMNSC-EVs的蛋白质组成进行了深入研究。通过聚类分析，我们发现LMNSC01和LMNSC02的EV蛋白组在整体上具有相似性，但又存在显著的差异。LMNSC01-EVs富含与细胞黏附、迁移、连接形成和神经突触发育相关的蛋白，而LMNSC02-EVs则富含与翻译起始和生物合成相关的分子。这些差异揭示了两种NSC系在功能上的不同，也提示了它们在治疗应用中的潜在不同作用机制。此外，我们还与之前的一项研究（Upadhya等，2020）进行了比较，发现LMNSC-EVs中包含一些在iPSC来源的NSC EVs中未被检测到的蛋白质，这些蛋白可能与免疫调节和吞噬作用有关。

在单细胞RNA测序分析中，我们观察到LMNSC01和LMNSC02在基因表达谱上存在显著差异。LMNSC01主要表达与神经元和部分胶质细胞相关的标记物，而LMNSC02则显示出与抑制性神经元、胶质细胞和OPCs相关的基因表达。这些结果表明，LMNSC02具有更广泛的分化能力，而LMNSC01则偏向于神经元分化。通过基因集富集分析（GSEA）和通路分析（IPA），我们进一步揭示了这些基因表达差异所涉及的生物学过程和通路，如神经发生、神经元发育、神经突触形成和神经保护机制。这些通路的激活或抑制可能解释了两种细胞系在功能上的不同表现。

在EV的功能测试中，我们使用了MTX诱导的脑类器官模型来评估其神经保护作用。结果显示，LMNSC01和LMNSC02来源的EVs能够有效恢复神经元和星形胶质细胞的数量，但对OPCs的修复作用有限。这一发现提示，虽然EVs在对抗化疗诱导的神经毒性方面具有显著效果，但其对不同细胞谱系的修复能力存在差异。这可能意味着，在设计EV治疗方案时，需要考虑不同细胞类型对治疗的反应差异，并可能需要结合其他治疗策略以实现全面的神经修复。

此外，我们还对HLA I类和II类分子的表达进行了分析。结果显示，LMNSC01和LMNSC02均不表达HLA II类分子，而HLA I类分子的表达水平在LMNSC02中略高于LMNSC01。这表明，两种NSC系在免疫表型上具有一定的相似性，但又存在细微的差异。这种免疫表型的分析对于理解EV在免疫调节中的作用具有重要意义，特别是在治疗中可能涉及免疫细胞的相互作用时。

本研究的结果不仅揭示了LMNSC系及其EVs的分子特征，还提供了其在神经保护和修复中的潜在应用。通过结合多种高通量分析技术，我们能够从细胞水平和分子水平全面理解NSC和其EVs的功能差异。这些发现为开发基于NSC的治疗策略提供了重要的理论依据和实验支持，同时也为未来研究EV在神经疾病中的应用提供了方向。然而，尽管这些成果令人鼓舞，仍需进一步研究以确定最佳的治疗方案和剂量，并探索其在更广泛的神经疾病模型中的应用潜力。此外，EV的临床转化仍面临挑战，如如何确保其在体内的稳定性和靶向性，以及如何优化其在不同疾病状态下的作用机制。这些挑战需要通过更多的基础研究和临床试验来解决，以推动NSC和其EVs在神经疾病治疗中的应用。