低剂量氯胺酮作用后的全基因组转录组分析揭示了抗抑郁治疗的新靶点

《Synapse》：Genome-Wide Translatome Analysis Following Low-Dose Ketamine to Reveal Novel Targets for Antidepressant Treatment

低剂量曲马酮通过激活前额叶皮层中SOM+中间神经元的VPAC2受体，改变皮层神经元活动模式，产生抗抑郁效果。研究发现，曲马酮上调蛋白质合成相关通路，并通过RiboSeq技术鉴定VPAC2为关键靶点，其激活导致皮层神经元活动复杂化，破坏协调性网络连接，并显著减少强迫游泳测试中的不动时间。研究为靶向VPAC2开发新型抗抑郁药物提供了依据。

　　低剂量的氯胺酮已被证明是治疗难治性单相和双相抑郁患者的高效抗抑郁药物。在给予单次静脉输注后，抑郁症患者通常在2小时内报告情绪改善，而氯胺酮的抗抑郁效果可以持续长达7天。鉴于这一显著的治疗效果，研究者们尝试“逆向翻译”氯胺酮的作用机制，以理解其如何引发抗抑郁效应。近年来，对氯胺酮引发的分子、细胞及回路层面变化的研究取得了重要进展。虽然增强蛋白质合成显然是氯胺酮发挥抗抑郁作用的一个关键因素，但该领域仍然缺乏对氯胺酮治疗剂量引发的蛋白质合成程序的全面理解。本研究采用结合核糖体的mRNA足迹分析和深度测序（RiboSeq）技术，揭示了在给予急性抗抑郁剂量的氯胺酮后，中脑前额叶皮层（mPFC）中活跃翻译的mRNA集合（即转录组）。基因本体（Gene Ontology, GO）分析证实，蛋白质合成的启动是氯胺酮在小鼠中发挥抗抑郁作用的特征之一，而基因集富集分析（GSEA）则指出，G蛋白偶联受体（GPCR）信号、代谢、血管化和结构可塑性可能在氯胺酮的作用中发挥关键作用。其中，VIPR2基因因其蛋白产物VPAC2作为血管活性肠肽（VIP）的GPCR，被识别为一个潜在的抗抑郁作用新靶点。我们进一步证明，VPAC2在mPFC中仅在生长抑素阳性（SOM+）神经元中表达，并且在体内的VPAC2激动剂处理可以复杂地调控前额叶皮层锥体神经元的活动，双向地改变其兴奋性，并破坏协调神经活动的结构。最终，我们展示了VPAC2激动剂的激活足以驱动抗抑郁反应，从而验证了我们通过靶向药物开发的方法的可行性。

抑郁症是全球导致残疾的主要精神疾病之一，尽管一线治疗方案主要针对单胺系统，但它们在相当一部分抑郁患者中效果不佳。对有反应的患者而言，需要数周甚至数月的持续治疗才能达到最佳疗效。而一次静脉注射N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）谷氨酸受体拮抗剂氯胺酮可以在110分钟内引发抗抑郁反应。尽管氯胺酮显示出巨大的治疗潜力，但其临床应用受到显著的缺点限制，如患者普遍报告的解离和精神病样副作用，这要求在临床环境中进行给药，从而限制了其对许多患者的可及性。这突显了识别NMDA受体拮抗作用下游分子级联反应的迫切需求，这些反应介导了氯胺酮的治疗效果。通过靶向这些下游效应器，可能开发出新型抗抑郁药物，以再现氯胺酮的疗效，同时避免不良反应。虽然氯胺酮的血浆半衰期仅为数小时，但一次低剂量的抗抑郁作用可以持续长达一周。那么，这种长期效应的基础是什么呢？已有多个研究小组报告称，氯胺酮及其特定的GluN2B型NMDA受体拮抗剂可以快速诱导蛋白质合成，观察到特定候选蛋白的差异调控（Autry, 2011; Li, 2010; Miller et al., 2014）。尽管靶向的Western blot实验提供了有价值的信息，但它们只能在已有假设的前提下提供见解。另一些研究小组则尝试通过无偏倚的方式理解氯胺酮对转录水平的影响。这些研究揭示了mRNA表达和基因网络的差异调控，但由于转录和翻译过程并非完全同步，因此在定义氯胺酮作用机制时仍可能存在假阳性和假阴性结果。例如，RNA结合蛋白如FMRP和ZPB1对mRNA的转录后调控可以作为mRNA表达与蛋白质合成之间的检查点，并且可以动态地受到内在和外在信号的调控，以抑制或允许特定转录本的翻译。

因此，我们希望通过评估氯胺酮引发的全部mRNA集合，来识别其长期抗抑郁效应的新机制。通过核糖体mRNA分析，我们能够获得某一时刻正在被核糖体翻译的mRNA的隔离和深度测序，从而提供定量且全基因组范围的基因差异调控评估。在本研究中，我们利用核糖体mRNA分析技术，比较了注射生理盐水、低剂量氯胺酮（3 mg/kg）和高剂量氯胺酮（100 mg/kg）的小鼠中脑前额叶皮层（mPFC）的翻译调控情况。基因集分析显示，具有行为效应的低剂量氯胺酮显著增强了与蛋白质合成启动和调控相关的基因集，同时显著富集了17个多样化的基因集，并下调了7个基因集。我们选择了VPAC2，这是一种可药理调控的GPCR，具有未被探索的抗抑郁作用，并且是内源性血管活性肠肽（VIP）的受体，进行进一步研究。我们证明了VPAC2在mPFC中仅在生长抑素阳性（SOM+）抑制性中间神经元中表达，并且激活VPAC2可以增强这些神经元的兴奋性。最终，我们展示了在体内的VPAC2激活对前额叶皮层锥体神经元活动的广泛影响，表明VPAC2可能成为未来抗抑郁干预的新靶点。

为了验证氯胺酮抗抑郁效果的剂量依赖性，我们首先进行了剂量校准实验。尽管氯胺酮在啮齿动物中的长期抗抑郁效果是稳健且可重复的，但所需的具体剂量会因物种、品系、年龄、性别甚至饲养条件而有所不同。因此，我们在开展基因组分析之前，首先校准了我们内部的抗抑郁剂量（图1A）。与注射生理盐水的对照组相比，注射3 mg/kg氯胺酮的小鼠在单次治疗后24小时，在强迫游泳测试（FST）中表现出抗抑郁样行为（图1B）。而其他剂量（10、50或100 mg/kg）并未显著改变FST中的不动时间。在测试前，我们测量了小鼠的运动速度，以确保在抗抑郁剂量下没有运动相关的混淆因素（图1C）。基于这些观察，我们选择了生理盐水（对照组）、3 mg/kg氯胺酮（抗抑郁样）和100 mg/kg氯胺酮（非抗抑郁样）作为实验组进行核糖体分析（图2）。

在实验中，所有组别的动物在治疗前接受了7天的每日5分钟的处理，以适应实验环境并减少非特异性处理导致的翻译变化。在注射生理盐水或氯胺酮30分钟后，小鼠被迅速处死，并从mPFC中分离组织。样本被处理以获得细胞质mRNA（用于RNA-Seq）和核糖体结合的mRNA片段（用于核糖体mRNA分析）。数据质量控制确认了mRNA样本的前额叶皮层身份（图S1）。生物信息学分析揭示了在低剂量和高剂量氯胺酮处理后，差异表达基因（DEGs）和差异翻译基因（DTGs）的集合。

在低剂量氯胺酮处理后，我们发现与蛋白质合成启动和调控相关的多个基因集显著上调，包括真核翻译延伸、翻译起始复合物形成和肽链延伸等（图3A）。这些结果与现有文献一致，表明mTOR依赖的蛋白质合成是氯胺酮长期抗抑郁效果的重要组成部分（Li, 2010）。与GO分析不同，基因集富集分析（GSEA）旨在检测一组功能相关基因的表达变化，这些基因的表达是协调调控的（Mootha, 2003）。GSEA分析显示，低剂量氯胺酮改变了与GPCR信号、神经元代谢、血管化和结构可塑性相关的多样化基因集（图3B）。其中，GPCR基因集的富集尤为显著，增加了1.83倍。这种富集是由G蛋白GNG4、血清素受体HTR1D和VIP受体VIPR2等核心基因的富集所驱动的（图3C）。

有趣的是，低剂量氯胺酮处理后下调的GSEA基因集主要涉及有丝分裂细胞的复制（图3D）。这些数据表明，抗抑郁剂量的氯胺酮增加了GPCR信号、代谢和现有细胞的结构重组，同时可能限制了新胶质细胞或其他有丝分裂细胞类型的产生。我们进一步验证了VIPR2作为低剂量氯胺酮引发的差异翻译基因（DTG）的重要性。低剂量氯胺酮样本中活跃翻译的mRNA代表了13,003个总基因（图4A，顶部）。与生理盐水处理的对照组相比，3 mg/kg氯胺酮处理的小鼠中，有61个基因的翻译显著增加，而22个基因的翻译显著减少（图4A，底部）。为了确保这些基因的翻译变化与抗抑郁样剂量的氯胺酮相关，而非由非特异性NMDAR拮抗作用引起的，我们排除了那些在100 mg/kg氯胺酮处理中也发生显著差异表达的基因（图4B,E），最终留下了49个显著上调的DTG和21个显著下调的DTG（图4C,F）。在这些DTG中，我们根据以下标准手动选择了进一步研究的目标：（1）该基因具有药理学可操作性；（2）基于其表达模式和已知的基因敲除或敲入模型中的表型，预测其副作用具有良好的前景；（3）该基因尚未在抑郁症中被明确地确定为相关因素。例如，Ms4a15（非特异性靶点）、Aqp1（全身表达）和Th（已知与抑郁症相关）等基因未被进一步研究。

基于GSEA数据中对GPCR在抗抑郁剂量氯胺酮作用中的重要性，以及VIPR2作为最显著差异上调的DTG之一，我们确定VIPR2是一个重要的候选基因。VIPR2的mRNA编码VPAC2蛋白，这是一种膜结合的Gs偶联GPCR。其主要的内源性配体是VIP，一种由VIP+抑制性中间神经元合成的28个氨基酸的神经肽。在下丘脑视交叉上核，超微结构数据表明VIP肽可能与GABA共同从VIP+中间神经元的突触中释放（Buijs et al., 1995; Castel and Morris, 2000），而在肌间神经丛中，VIP+中间神经元的高频刺激会引发VIP肽的释放，并导致连接细胞的缓慢去极化（Willard, 1990）。如果这一机制在mPFC中得到保留，那么我们观察到的低剂量氯胺酮处理后VPAC2的表达上调可能会促进VIP+中间神经元的突触后伙伴的延迟且持续的兴奋性增强。

为了验证VPAC2是否在mPFC中特异性地表达，并且其激活是否能够驱动抗抑郁样行为，我们进一步研究了VPAC2在不同神经元类型中的功能表达。首先，我们确定了哪些神经元类型在mPFC中表达VPAC2。为此，我们交叉使用了一种依赖Cre的tdTomato报告小鼠品系（Ai14）（Madisen et al., 2010）与表达Cre的中间神经元亚群，并对mPFC中的荧光神经元进行电生理记录。分析SOM+、PV+和锥体神经元的电生理参数表明，PV+中间神经元表现出较短的突触后反应潜伏期（图S3B,D）和较短的动作电位（AP）半宽（图S3C,D），与SOM+和锥体神经元相比。此外，PV+和SOM+中间神经元的电容均低于锥体神经元（图S3F），而SOM+细胞的膜电阻高于PV+或锥体神经元（图S3G）。

在皮层微回路中，VIP+中间神经元倾向于通过快速GABAA神经传递抑制SOM中间神经元。鉴于已知的皮层神经元的细胞架构和表达模式（Joo, 2004），我们假设SOM神经元会表达VPAC2，并且对VIP肽敏感。为了测试这一假设，我们评估了VPAC2激动剂对这三种mPFC神经元兴奋性的影响。在突触阻断条件下（NBQX、APV和Picrotoxin），我们注射了足以引发5±1次AP的去极化电流，并在稳定AP反应后，用选择性VPAC2激动剂Bay55（0.5 μM）进行洗脱处理，观察其对神经元兴奋性的影响（图5）。当记录SOM+神经元时，Bay55的处理显著增加了AP的次数（基础：4.59±0.099次；Bay55：11.16±1.994次；n=9个细胞；p=0.0002，配对t检验）。加入GDPβs到记录电极中可以阻止Bay55的兴奋效应（图S4），这表明VPAC2激动剂通过激活G蛋白偶联信号通路，如激活腺苷酸环化酶和增加细胞内cAMP水平，来增强SOM+中间神经元的兴奋性。尽管VIP+中间神经元主要与SOM+中间神经元形成突触联系，它们也会与PV+和锥体神经元形成突触（Dávid et al., 2007; Hajós et al., 1998）。然而，与SOM+神经元不同，当记录PV+或锥体神经元时，VPAC2激动剂对兴奋性的改变并不显著（图5B,C）。这些结果表明，VPAC2在不同神经元类型中具有特异性表达，其激活会导致mPFC中SOM+中间神经元的偏好性兴奋。

为了进一步探究VPAC2激活是否能够改变前额叶皮层锥体神经元的活动，并进而影响整个神经网络的动力学，我们接下来研究了系统性激活VPAC2对mPFC微回路活动的影响。虽然急性脑片实验提供了关于VPAC2激动剂对已知神经元直接药理学作用的机制见解，但其在完整神经回路中的整体影响却难以预测。为此，我们采用细胞分辨率的钙成像技术，在自由活动的小鼠中观察了VPAC2激活对mPFC神经元活动的影响。通过立体定位注射AAV1-CaMKII-GCaMP6f（图6A），我们标记了mPFC中的锥体神经元，并植入GRIN透镜以使用头戴式微型显微镜进行体内钙成像（图6B,C）。在恢复和适应后，小鼠在开放场中进行10分钟的基线记录，然后注射载体或Bay55（0.2 mg/kg），并在给药后进行20分钟的记录（图6D）。钙信号被提取并反卷积为推断的尖峰活动（图6E），从而允许我们比较整个实验过程中细胞内的调节变化。

与我们的假设相反，VPAC2激活并未导致锥体神经元活动的单向抑制，而是诱导了双向调节：在Bay55处理后，锥体神经元中显著增加的激活和抑制比例均高于载体处理组（图6F–I）。此外，Bay55增强了激活和抑制的强度：抑制细胞中的抑制强度显著高于载体处理的对照组，而激活细胞中的激活强度增加，但程度较轻（图6J–K）。这些发现表明，VPAC2激动剂并不通过中间神经元介导的抑制作用全局沉默锥体神经元，而是通过驱动不同子群体的活动模式，改变整个前额叶网络的动力学。这种双向调节可能反映了完整皮层微回路的递归性质，以及该区域的前馈和反馈连接的影响。

为了进一步探索VPAC2在神经网络中的作用，我们还研究了其对细胞间活动相关性的改变。我们计算了处理前后细胞对之间的相关性矩阵，并使用Z分数标准化的Spearman相关系数进行分析（图7A–E）。Bay55处理显著降低了锥体神经元之间的整体相关性（图7G），表明VPAC2激活会破坏整个群体的协调活动。我们还通过计算相关性矩阵的相似性，评估了相关性结构的变化。在每对基线和处理后的记录（使用相同的细胞集合，通过CaImAn CNMF-E处理为拼接记录）中，我们计算了各自细胞对之间的Pearson相关系数。数值接近1表明相关性结构被保留，即在不同记录中表现出协调活动的相同细胞群体；而数值接近0则表明相关性结构被破坏，与细胞群体协调活动的程度无关（图7H–I）。

为了评估网络关系结构的变化，我们使用了处理前后Z分数标准化的Spearman相关系数之间的绝对变化值来计算差分矩阵（图7C,F,H）。这些结果表明，VPAC2激活比载体处理更显著地破坏了相关性结构。这些发现支持了VPAC2激活能够降低前额叶网络动态的连贯性，并重新组织功能性连接结构的假设。

我们还测试了VPAC2激活是否能够引发抗抑郁样行为。在确定低剂量氯胺酮能够选择性地增加VPAC2表达，并且VPAC2激动剂能够特异性地增强SOM+中间神经元的兴奋性，进而复杂地调节锥体神经元动力学后，我们进一步研究了VPAC2激活是否能够引发抗抑郁样行为。为此，我们对小鼠进行了亚慢性处理，使用VPAC2激动剂Bay55（0.2 mg/kg）进行每日皮下注射，并在第5天评估其在强迫游泳测试（FST）中的行为影响。Bay55处理显著减少了小鼠的不动时间，与载体处理的对照组相比，表现出抗抑郁样效果（图8A）。为了确保这种行为效应不是由整体活动水平变化引起的，我们使用开放场测试测量了基线运动水平，并确认Bay55处理在该剂量下并未显著改变运动活动（图8B）。这些结果支持了VPAC2激活作为产生抗抑郁样效应的新机制。

尽管目前尚无明确证据表明VPAC2在重度抑郁症中起作用，但已有研究显示其在精神疾病中的潜在作用。VIPR2基因的拷贝数变异已被发现与精神分裂症的风险显著相关（Vacic, 2011），这表明该基因在维持正常脑功能中的重要性。VIPR2与精神分裂症的关联进一步支持了VPAC2信号在维持皮层回路稳定性和健康认知功能中的广泛作用，这进一步强调了其在抑郁症及相关精神疾病中的潜在相关性。我们的数据支持了一种模型，即氯胺酮通过增强SOM+中间神经元中VPAC2的表达，改变其对VIP/PACAP的敏感性，并塑造未来的网络动态。这种延迟的信号增强可能代表了氯胺酮的分子效应如何转化为前额叶回路功能的持续变化。

本研究展示了通过无偏倚的翻译组分析，利用已知的抗抑郁药物来发现和验证新治疗靶点的实用性。通过利用细胞或回路特异性的分子靶点，如VPAC2，可能开发出更精准的抗抑郁疗法，以提高疗效并减少副作用。要充分实现这一治疗潜力，需要进一步探索VPAC2在细胞、回路和行为层面的功能。

尽管本研究取得了重要进展，但也存在一些局限性。首先，所有实验均在未经历慢性压力的“新手”小鼠中进行，这使得我们能够识别氯胺酮的初级分子和回路层面的影响，而避免了慢性压力的干扰。然而，仍需确定在更贴近抑郁症病理生理学模型中，包括VPAC2的上调，是否同样被激活。未来的研究应在慢性压力或皮质酮暴露的模型中进行，以验证这些发现的翻译相关性。其次，虽然我们证明了VPAC2的激活足以产生抗抑郁样行为，但我们并未测试VPAC2是否是氯胺酮治疗作用的必要条件。直接证据需要通过药理学阻断或基因缺失方法来获取。第三，我们未评估氯胺酮的不同立体异构体的影响。鉴于有研究表明（R）-氯胺酮可能比（S）-氯胺酮具有更高的抗抑郁效果和更少的副作用，需要进一步确定VPAC2的上调是否由其中一个异构体优先驱动。最后，我们的行为分析仅限于“新手”动物的强迫游泳测试（FST）。尽管FST是评估抗抑郁样活性的常用方法，但未来还需要在更广泛的表型和基于压力的抑郁症模型中评估VPAC2激动剂的影响。

在实验过程中，我们采用了多种技术和方法来确保研究的严谨性。首先，在动物实验方面，所有研究均严格遵循瑞士联邦动物保护和福利条例，以及国际实验室动物护理与使用协会（AAALAC）的规定，并获得当地兽医机构的明确批准。小鼠被饲养在12小时光照/黑暗周期中，环境温度约为20°C，湿度约为55%。常规啮齿动物饲料和自来水可供自由获取。小鼠在约P30时断奶，并按性别分群饲养，每笼不超过三只小鼠。在分析时，所有生理、行为和组织学研究均使用2至3个月大的雄性小鼠。在Inscopix的研究中，所有体内成像实验均使用4至6个月大的雄性小鼠，并维持在反转的12小时光照/黑暗周期中，食物和水可自由获取。每只小鼠在整个研究过程中与同种小鼠共同饲养，并通过多孔隔板与同种小鼠半分离，以保持GRIN透镜植入的完整性。所有实验均在动物的黑暗周期中进行。

在基因组分析方面，我们使用了核糖体mRNA分析和RNA测序技术。具体来说，我们通过TruSeq Ribo Profile试剂盒（Illumina）制备了核糖体分析和RNA测序的文库，并按照制造商的协议进行操作。简而言之，冷冻的脑组织样本在干冰上研磨，并在含有1% TritonX-100、0.1% NP40、1 mM DTT、DNase（0.01 U/μL）和100 μg/mL环己亚胺的裂解缓冲液中解冻。将样本的四分之一用于核糖体足迹分析，通过在室温下用RNase消化45分钟；其余样本用于RNA测序文库制备流程，并通过酚-氯仿提取分离核糖体保护的mRNA片段。为了去除核糖体RNA（rRNA），我们使用了RiboZero磁珠试剂盒（Illumina）。随后的步骤，包括PAGE纯化、末端修复、接头连接、逆转录和环化，均按照制造商的协议进行，并再次通过PAGE凝胶纯化以去除残留的引物。所有扩增的文库均通过毛细管电泳和高灵敏度DNA芯片（Agilent Technologies）进行质量评估，并通过定量PCR和测序文库定量试剂盒（KAPA Biosystems）在Roche Light Cycler 480上进行定量。通过HiSeq2500仪器进行测序，使用版本4的化学试剂，进行50个循环。

在生物信息学分析方面，我们按照先前的方法（Grabole et al., 2016）进行了数据处理和分析。简而言之，我们通过FASTX Toolkit去除了RNA测序和核糖体分析数据中的连接标签，并去除了所有映射到rRNA、tRNA或线粒体rRNA的读数。剩余的读数被映射到小鼠基因组（RefSeq v38）上，并通过TopHat进行比对。最终，所有唯一映射到基因的读数被提取用于表达分析。我们应用了edgeR算法进行差异基因表达分析，并识别出在对照组中表达水平变化超过150%或低于70%的基因，且Bonferroni校正后的p值小于0.01的基因被视为显著变化。我们还应用了camera算法进行GSEA分析，使用了来自Roche内部数据库RONET收集的基因集。GO富集分析使用了Fisher精确检验。

在电生理学方面，我们采用了多种方法来研究VPAC2激活对神经元活动的影响。首先，我们使用了急性脑片记录技术，对小鼠的神经元活动进行了研究。具体而言，2至3个月大的雄性小鼠在使用异氟烷麻醉后被断头，大脑迅速取出并置于冰冷的改良NMDG溶液中（成分：110 mM NMDG、110 mM HCl、3 mM KCl、10 mM MgCl?·6H?O、1.1 mM NaH?PO?·H?O、0.5 mM CaCl?·2H?O、25 mM葡萄糖、3 mM丙酮酸、10 mM抗坏血酸、25 mM NaHCO?、305–310 mOsm）。使用Leica VT1200S振动刀切取350 μm的mPFC冠状切片。切片在34°C的氧合NMDG溶液中恢复30分钟，然后转移到一个保持室温的维持室中，至少再培养30分钟，之后进行全细胞记录。所有ACSF溶液均用95% O?/5% CO?气体维持稳定的氧合和pH。

在全细胞膜片钳记录中，我们使用了硼硅酸盐玻璃电极，并填充了钾谷氨酸内液（成分：120 mM K Gluconate、10 mM Hepes、10 mM D-Sorbitol、1 mM MgCl?·6H?O、1 mM CaCl?·2H?O、1 mM EGTA、5 mM磷酸肌酸二钠盐、2 mM ATP二钠盐、0.3 mM GTP钠盐，pH调整为7.3，渗透压为290 mOsm）。全细胞膜片钳记录通过MultiClamp 700B（Axon Instruments）进行，数据以20 kHz的频率进行数字化（Digidata 1550，Axon Instruments），并以2 kHz的频率进行滤波，最终通过pClamp软件进行记录。原始数据通过MiniAnalysis（Synaptosoft）和自定义的IgorPRO（Wavemetrics）宏进行分析，并通过GraphPad Prism进行统计分析，如文中所述。电极的电阻范围为2至5 MΩ，系列接入电阻范围为4至20 MΩ，并在记录过程中进行监控。如果漏电流超过200 pA、接入电阻超过20 MΩ，或在记录过程中变化超过15%，则细胞被丢弃。我们选择了位于前额叶皮层第III层的锥体神经元进行记录，这些神经元可以通过表观荧光成像识别。

在数据处理过程中，我们采用了一种基于DeepLabCut（Mathis et al., 2018; Nath et al., 2019）的内部行为追踪模型，对小鼠的运动速度进行了计算。具体而言，我们通过平均七个体部位的坐标，计算了动物在实验场地中的中心质量（COM），并将其与实验场地的帧数和采样率相乘，以获得平均运动速度（cm/s）。为了确保数据质量，我们使用了Inscopix数据处理软件（IDPS）1.9.4进行运动校正和细胞分类。对于所有其他分析，我们使用了Python 3.9.13（包含pandas 1.5.3、NumPy 1.23.5和seaborn 0.12.2）。

在计算资源方面，我们使用了高性能计算设备进行计算密集型的数据预处理。具体来说，我们使用了Lambda Quad深度学习工作站，该工作站配备了四块NVIDIA RTX A4500 GPU（每块20 GB内存，用于DeepLabCut预测）和64个CPU（用于基于并行处理的分析，如TMI和细胞间相关性的排列组合测试）。这一配置确保了高效的数据处理和分析，从而支持了本研究的结论。