一种用于培养新生小鼠小脑原代细胞并对浦肯野细胞进行基因操作的有效方法

《Journal of Neuroscience Methods》：A robust method for primary cerebellar culture and genetic manipulation of Purkinje cells from postnatal mice

本研究建立了一种单一培养基的小脑初级细胞培养方法，支持浦肯野细胞的高效存活与发育，并通过AAV病毒和 antisense oligonucleotides（ASO）实现基因精准调控。结果显示，来自 постнатальный день 1的小脑组织培养的浦肯野细胞具有更复杂的树突结构，且AAV转染和ASO沉默RORα基因均不影响细胞形态，同时验证了钙成像技术的功能性。该 protocol统一了现有方法，减少动物使用，适用于神经发育与疾病模型研究。

　　在这项研究中，科学家们专注于开发一种新的方法，用于在体外培养小鼠的皮层颗粒细胞（Purkinje cells），这些细胞是小脑中的关键神经元类型。小脑在发育过程中经历了一个漫长的成熟阶段，延续至青春期，使其对环境因素特别敏感。因此，小脑发育过程中出现的缺陷可能导致多种疾病，如共济失调、自闭症谱系障碍、精神分裂症和注意力缺陷多动障碍等。为了更好地研究这些疾病，科学家们需要能够稳定地在体外培养小脑神经元的方法，尤其是Purkinje细胞，因为它们在小脑细胞总数中占比较小，并且对培养条件高度敏感。

当前的研究提出了一种新的培养方法，该方法不仅支持Purkinje细胞的发育，还能实现高效的基因操作。该方法的主要优势在于其单介质配方，消除了需要单独的培养和维持介质的需求。此外，该方法采用单个小脑独立培养，保留了支持细胞的天然数量，避免了平行培养的需要，从而减少了实验中的变异性。这种方法还通过使用出生后的小脑组织，降低了实验中对动物的使用量。实验中使用了两种基因操作技术：腺相关病毒（AAV）转导和反义寡核苷酸（ASO）转染，以实现对Purkinje细胞的特定基因表达调控。

在实验设计中，研究人员使用了FVB/NHsd小鼠，并结合Pcp2-Cre转基因小鼠来特异性地标记Purkinje细胞。通过在特定时间点（如第1天和第18天）进行基因操作，研究人员能够评估不同发育阶段Purkinje细胞的发育情况。实验中，通过使用钙成像技术（Fluo-4 AM）验证了培养的神经元功能活性，结果显示这些神经元能够产生自发的钙波动，表明其在体外具有功能活性。

研究结果表明，从出生后1天（P1）小鼠中分离的Purkinje细胞在形态上更接近其体内状态，尤其是在发育阶段相似的情况下。这些细胞表现出更复杂的树突结构和更大的细胞面积。相比之下，从胚胎第18天（E18）小鼠中分离的Purkinje细胞则显示出相对较少的树突复杂性。这说明培养时的发育阶段对Purkinje细胞的成熟过程具有重要影响。此外，研究人员使用了ASO来靶向调控RORα基因的表达，发现这种基因表达的下调显著减少了Purkinje细胞的面积和树突复杂性，而对树突长度没有明显影响。这表明ASO在体外对Purkinje细胞具有一定的调控能力。

在钙成像实验中，研究人员确认了Purkinje细胞、颗粒细胞和胶质细胞的功能活性，展示了它们在体外环境中能够产生自发的钙波动。这些结果表明，该培养系统不仅支持Purkinje细胞的发育，还能够维持其功能性活动。这一发现对于研究小脑发育过程中的神经活动具有重要意义。

通过使用AAV转导技术，研究人员能够高效地在Purkinje细胞中实现基因表达的调控，而不会影响其形态或发育。这种技术适用于短期和长期的基因操作实验，为小脑发育和疾病模型的研究提供了有力工具。相比之下，传统的基因操作方法如核转染（nucleofection）通常需要在培养前进行，限制了其在发育过程中的应用。因此，AAV技术的引入为研究小脑发育提供了更大的灵活性。

研究还讨论了该方法在不同研究领域的潜在应用，包括分子、细胞和功能层面的研究。由于Purkinje细胞的发育过程涉及多个阶段，如迁移、神经突延伸和成熟，因此，该方法支持这些过程的研究，同时提供了对基因表达和功能活动的调控手段。此外，该方法还适用于研究其他小脑细胞类型，如颗粒细胞和胶质细胞，并且可以与电生理学技术（如膜片钳记录）结合使用，以进一步探究这些细胞的电活动特性。

然而，研究也指出了该方法的一些局限性。例如，尽管该方法支持Purkinje细胞在体外存活20天，但更长的培养时间以研究小脑发育的后期阶段或疾病进展仍是一个挑战。此外，体外培养无法完全再现小脑神经元在体内时的极化树突结构、空间分布以及与传入和传出神经元的复杂相互作用。因此，虽然该方法在研究小脑发育和疾病机制方面具有显著优势，但在某些情况下可能需要结合其他技术，如器官片培养或体内电穿孔，以更全面地模拟小脑的自然环境。

该研究的贡献在于提供了一种更简单、更有效的体外培养小脑神经元的方法，支持Purkinje细胞的发育和基因操作，同时减少了实验的复杂性和动物使用量。这一方法为未来的小脑研究，包括药物筛选和疾病模型的建立，提供了坚实的基础。此外，研究还强调了基因操作技术在小脑神经元研究中的重要性，展示了AAV和ASO在调控基因表达方面的潜力，为探索神经发育和疾病机制提供了新的工具。