体内线粒体碱基编辑恢复LHON小鼠模型基因型与视觉功能

《Nature Communications》：In vivo mitochondrial base editing restores genotype and visual function in a mouse model of LHON

本研究针对Leber遗传性视神经病变(LHON)这一缺乏理想动物模型的线粒体疾病，利用高保真线粒体碱基编辑器Hifi-DdCBE成功构建了携带致病性MT-ND4 G11778A突变的小鼠模型。通过AAV递送的sTALED-V28R进行体内基因治疗，有效恢复了视网膜神经节细胞功能和视觉表现，并在患者来源细胞中验证了治疗潜力，为线粒体DNA相关疾病的治疗提供了新策略。

　　

在生命科学的微观世界里，线粒体被誉为细胞的"动力工厂"，它们拥有独立的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA）。当这些微小的基因组发生突变时，可能引发一系列严重的遗传性疾病，其中Leber遗传性视神经病变（LHON）便是典型代表。这种母系遗传的疾病主要由于MT-ND4基因的G11778A点突变导致视网膜神经节细胞（RGC）退化，患者通常在青年期出现进行性视力丧失，最终可能达到法律盲标准。令人遗憾的是，目前仅有的药物治疗idebenone效果有限且价格昂贵，而传统基因治疗方法在LHON中收效甚微。

更令人困扰的是，科学界长期缺乏能够真实模拟人类LHON突变的动物模型，这严重阻碍了疾病机制研究和治疗开发。虽然近年来出现的线粒体碱基编辑工具如DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）和TALE连接脱氨酶（TALED）为靶向线粒体DNA编辑带来了希望，但第一代工具DddA11存在严重的脱靶效应和胚胎发育毒性，限制了其应用。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，韩国多个研究机构的联合团队通过创新性的基因编辑技术，成功克服了这些挑战。他们利用高保真DdCBE（Hifi-DdCBE）成功构建了首个小鼠LHON模型，并开发了基于AAV的体内基因治疗方法，为线粒体疾病治疗开辟了新途径。

研究采用了多项关键技术：高保真线粒体碱基编辑器（Hifi-DdCBE）用于构建疾病模型；腺相关病毒（AAV）载体递送系统用于体内基因治疗；优化版TALE连接脱氨酶（sTALED-V28R）用于精确基因校正；视网膜光学相干断层扫描（OCT）和电生理记录用于功能评估；患者来源尿液细胞用于临床前验证。样本包括C57BL/6N小鼠和来自19岁男性LHON患者的尿液衍生细胞。

DddA11诱导广泛脱靶效应并导致小鼠胚胎发育停滞

研究人员首先尝试使用活性增强的DddA11基编辑器在小鼠MT-ND4基因中引入G11185A突变（对应人类G11778A位点）。尽管在胚胎期观察到了38%-75%的编辑效率，但成功出生的幼鼠中却未检测到预期编辑。进一步分析发现，DddA11不仅诱导了目标突变，还产生了大量非预期编辑（G11182A和C11188T），更重要的是，全基因组测序揭示了广泛的线粒体DNA脱靶突变，这可能是导致胚胎发育停滞的主要原因。

Hifi-DdCBE实现高效精准编辑并成功构建突变小鼠

面对DddA11的局限性，研究团队转而采用含有T1391A变体的Hifi-DdCBE。这一新编辑器在细胞实验中显示出良好的安全性，不会引起明显的细胞毒性。将其应用于小鼠胚胎后，成功获得了携带G11185A突变的活产小鼠，编辑效率显著且脱靶效应大幅降低。更重要的是，这些突变能够稳定遗传给后代，并在不同组织中保持一致的异质性水平。

MT-ND4突变小鼠呈现RGC变性和特异性基因型

组织学分析表明，突变小鼠在其他组织中未见异常，但在视网膜中表现出明显的LHON样表型。当G11185A异质性水平超过20%时，小鼠出现视网膜厚度减少、神经节细胞层（GCL）变薄和RGC数量下降。光学相干断层扫描（OCT）进一步证实了这些结构性改变。令人惊讶的是，尽管外周组织异质性水平相对较低，但分离的RGC中突变负荷显著更高，这解释了为何在相对低异质性水平下仍能观察到表型。机制研究表明，RGC死亡可能通过自噬而非凋亡途径发生，并伴随神经炎症反应增强。

sTALED-V28R恢复MT-ND4突变位点并改善线粒体功能

研究团队随后开发了治疗策略，使用经过优化的腺嘌呤碱基编辑器sTALED-V28R来纠正致病突变。在体外实验中，AAV递送的sTALED-V28R在突变小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中实现了约8%的突变纠正率，并显著改善了ATP生产和氧消耗速率，证明其在线粒体功能恢复方面的潜力。

AAV介导的线粒体基因治疗展现治疗效果

在体内治疗实验中，研究人员对2周龄的突变小鼠进行玻璃体内AAV注射。治疗后8周，OCT分析显示AAV治疗组视网膜结构明显改善，厚度恢复至野生型水平。免疫荧光分析证实Brn3a阳性的RGC数量增加约1.34倍。基因型分析更显示，AAV治疗显著降低了RGC中的突变负荷，在某些个体中校正频率最高达到64.55%。重要的是，治疗并未引起明显的核DNA或线粒体DNA脱靶效应。

AAV治疗改善突变小鼠视觉功能

在26周龄的老年突变小鼠中，研究观察到了明显的视觉功能缺陷。PBS处理的突变小鼠在视动性眼震（OKN）测试中表现出视觉敏锐度下降，在电图（ERG）中锥细胞介导的光负反应（PhNR）波幅显著降低——这是RGC功能异常的直接证据。而AAV治疗组则在这两项测试中表现出明显的功能恢复，达到与野生型小鼠相当的水平。

在患者来源细胞中有效纠正致病LHON突变

最后，研究团队在来自LHON患者的尿液衍生细胞中测试了编辑器的治疗潜力。通过优化线粒体靶向序列（MTS）和脱氨酶组分，他们开发出增强型sTALED（esTALED），在携带纯合G11778A突变的患者细胞中实现了高达63%的纠正效率。引入TadA8e变异体（V28R或R111S）后，编辑器在保持高效的同时显著减少了非预期编辑。

这项研究的成功不仅提供了首个可靠的LHON小鼠模型，为疾病机制研究提供了重要工具，更展示了基于碱基编辑的线粒体基因治疗的巨大潜力。通过高保真编辑工具和优化递送策略，研究人员实现了从模型构建到治疗验证的全链条突破。特别值得注意的是，治疗在相对低异质性水平下即显示出效果，暗示即使在症状出现前进行干预也可能有效，为预防性治疗提供了理论依据。

然而，研究也存在一定局限性，如编辑器仍会产生少量非预期编辑，且物种间阈值差异需要进一步探索。尽管如此，这项工作无疑为线粒体遗传病的治疗开辟了新天地，将精准基因编辑技术成功应用于线粒体领域，为众多线粒体疾病患者带来了新的希望。随着技术的不断优化和临床转化的推进，线粒体碱基编辑有望成为继核基因治疗后的又一突破性治疗策略。