NR2F1/2核受体突变的小鼠中，颅神经嵴发育缺陷会导致广泛的颅面畸形

《Developmental Biology》：Cranial neural crest shortage leads to extensive craniofacial anomalies in mice mutant for the NR2F1/2 nuclear receptors

【中文摘要】本研究通过条件性敲除小鼠NR2F1和NR2F2基因，发现两者在颅神经嵴迁移后期起冗余作用，缺失导致严重上颌骨缺失和腭裂。RNA测序显示PLCG2等基因下调，免疫荧光证实神经嵴细胞迁移减少，且PLCG2与NR2F1/2调控元件共定位，提示其为直接靶点。该研究首次明确NR2F1/2在哺乳动物颅神经嵴迁移阶段的必要性及关键调控靶点。

　　核受体（Nuclear Receptors, NR）是一类重要的转录因子，它们在多种生物过程中发挥关键作用，包括发育、代谢和分化。在哺乳动物中，NR2F1和NR2F2被提出为早期神经嵴基因表达的广泛调控因子，但它们在发育过程中的具体时间、范围和冗余性仍不明确。尽管单独敲除NR2F1和NR2F2的小鼠模型只表现出轻微的颅面部表型，但这项研究通过同时敲除这两种基因，揭示了它们在神经嵴发育过程中的关键作用。

神经嵴细胞是胚胎发育中一种短暂的细胞群体，它们能够分化为多种结构，包括色素细胞、外周神经系统以及大部分颅面部骨骼。在研究中，作者使用了两种不同的Cre驱动系统——Wnt1-Cre和Pax3-Cre——对神经嵴细胞进行条件性敲除。结果显示，同时敲除NR2F1和NR2F2的神经嵴细胞会导致严重的中面部裂隙、上颌和腭的丧失，以及除远端下颌外所有其他面部骨骼的发育不全。这些表型源于中孕期神经弓间充质的严重缺乏，而这种缺乏最早在胚胎第8.75天（E8.75）的神经嵴迁移流的尾部显现。在更早的阶段，通过RNA测序发现许多迁移相关的神经嵴基因表达下调，包括一个可能的直接靶标——磷脂酶Plcg2。这些发现表明，NR2F1/2在神经嵴细胞的后期发育中起着至关重要的作用。

为了进一步理解NR2F1和NR2F2在神经嵴中的功能，研究团队首先分析了这些基因在小鼠胚胎中的表达模式。通过原位杂交（Whole Mount In Situ Hybridization, WMISH）技术，研究人员发现NR2F1和NR2F2在神经嵴细胞中具有动态的表达模式。在神经嵴形成的早期阶段，NR2F1的表达在神经板边缘更为明显，而NR2F2的表达则主要出现在颅部中胚层。随着神经嵴细胞的分化和迁移，这两种基因的表达在神经板上显著增加，特别是在形成第一神经弓（PA1）的阶段。在中孕期，NR2F1和NR2F2的表达在上颌和腭区域逐渐减弱，而在下颌区域则保持较高水平。这一表达模式表明，NR2F1和NR2F2可能在神经嵴细胞的后期迁移过程中起着重要的调控作用。

在进一步的功能分析中，研究团队通过条件性敲除NR2F1和NR2F2，观察到这些基因的缺失对颅面部骨骼发育产生了显著影响。Wnt1-Cre和Pax3-Cre驱动的双条件敲除小鼠表现出类似的表型，包括上颌和下颌的显著缺失，以及中面部裂隙。值得注意的是，尽管NR2F2在某些情况下显示出更强的表型，但NR2F1的表达在早期神经嵴细胞中更为显著，这可能解释了为何在某些情况下NR2F1的缺失并未导致明显的颅面部异常。然而，当这两种基因同时缺失时，神经嵴细胞的大量减少导致了严重的表型，包括面部骨骼的发育不全和中面部裂隙。

此外，研究团队还分析了这些基因在神经嵴细胞迁移过程中的具体作用。他们发现，在双条件敲除小鼠中，神经嵴细胞的迁移受到显著影响，特别是在第一神经弓的尾部区域。这一区域的神经嵴细胞数量明显减少，导致了上颌和腭的发育缺陷。同时，RNA测序结果显示，许多与神经嵴迁移或上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）相关的基因在NR2F1/2缺失的情况下表达下调，包括磷脂酶Plcg2。Plcg2的表达在神经嵴细胞中逐渐增强，特别是在迁移阶段，而其在双条件敲除小鼠中的缺失可能与神经嵴细胞的迁移障碍有关。

为了验证这些基因的缺失是否影响了神经嵴细胞的分化或迁移，研究团队还进行了组织学分析。他们发现，双条件敲除小鼠的神经嵴细胞在迁移过程中表现出明显的减少，尤其是在形成上颌和腭的阶段。这些细胞的减少可能导致了面部骨骼的发育不全和中面部裂隙。此外，通过免疫荧光分析，研究人员发现，NR2F1和NR2F2的缺失导致了迁移神经嵴细胞的减少，但并未显著影响细胞的增殖或凋亡。这一发现支持了NR2F1/2在神经嵴细胞的生成和迁移中的关键作用，而不是在细胞分化过程中。

研究团队还探讨了NR2F1和NR2F2在神经嵴细胞中的冗余性。他们发现，NR2F1和NR2F2在神经嵴细胞的后期迁移阶段共同表达，这可能解释了为何它们的缺失会导致严重的表型。此外，NR2F6在神经嵴细胞的早期阶段与NR2F1共同表达，可能在某些情况下补偿NR2F1的缺失。然而，NR2F2的缺失对神经嵴细胞的影响更为显著，这可能与其在神经嵴细胞迁移和分化中的作用有关。

研究结果表明，NR2F1/2在神经嵴细胞的后期迁移阶段起着至关重要的作用，而NR2F6可能在早期阶段起到一定的补偿作用。这些发现不仅揭示了NR2F1/2在神经嵴细胞发育中的重要性，还支持了它们在从鱼类到哺乳动物的神经嵴发育中的保守性。此外，研究还指出，NR2F1和NR2F2的缺失可能导致了面部骨骼的发育不全，特别是在上颌和腭区域，而下颌则相对保留。这可能与NR2F1和NR2F2在不同神经弓中的表达模式有关。

尽管研究团队使用了多种方法来分析NR2F1/2在神经嵴细胞中的功能，但他们的研究仍存在一定的局限性。例如，Wnt1-Cre和Pax3-Cre驱动的条件性敲除可能无法完全反映NR2F1/2在早期神经嵴细胞中的作用，因为它们的激活时间可能较晚。此外，研究中使用的RNA测序方法可能无法准确反映神经嵴细胞在整体胚胎中的表达情况，因为它们与其他组织的基因表达混合在一起。这些局限性提示未来的研究需要使用更精确的Cre驱动系统和更特异的基因表达分析方法，以进一步揭示NR2F1/2在神经嵴细胞发育中的具体作用。

总的来说，这项研究通过分析NR2F1和NR2F2在小鼠神经嵴细胞中的表达模式和功能，揭示了它们在面部骨骼发育中的关键作用。研究结果不仅为理解神经嵴细胞的发育提供了新的视角，还为相关疾病的机制研究提供了理论依据。这些发现对于未来的临床研究和药物开发具有重要意义，特别是在涉及神经嵴相关疾病的情况下。