基于深度学习的酶最佳pH值预测及点突变设计以提高酸耐受性

《ACS Synthetic Biology》：Deep Learning-Based Prediction of Enzyme Optimal pH and Design of Point Mutations to Improve Acid Resistance

CatOpt是一种基于深度学习的酶最适pH预测模型，结合ESM-2嵌入、多尺度CNN和多头自注意力机制，显著优于现有模型（RMSE=0.833，R2=0.479），并可通过注意力权重解释关键氨基酸残基。实验验证其指导的点突变设计可有效提升Pyrococcus horikoshii二乙酰齐多巴糖酶在酸性条件（pH4.5/5.5）的活性约7%。

　　在合成生物学快速发展的背景下，酶作为生物催化剂，在工业应用中发挥着至关重要的作用。从食品发酵到废物转化，再到绿色生物制造，酶的性能直接影响了生产效率和环境友好性。然而，酶的催化活性受到多种因素的影响，其中pH值是一个关键变量。因此，准确预测酶的最佳pH值（pHopt）对于酶的筛选、工程改造以及在特定环境下的应用具有重要意义。传统的酶活性实验通常需要大量的时间和资源，难以满足快速筛选的需求。为了解决这一问题，研究者们开发了多种基于机器学习的预测方法，但这些方法往往只能预测酶的pH偏好范围（如酸性或碱性偏好），而无法提供具体的pHopt数值。此外，许多现有模型缺乏对关键序列信息的解释能力，限制了其在酶设计中的应用。

为应对上述挑战，本研究提出了一种新的深度学习模型——CatOpt，该模型能够从蛋白质序列中直接预测酶的最佳pH值，并提供对关键序列信息的可解释性。CatOpt结合了预训练的蛋白质语言模型（如ESM-2）、多尺度卷积神经网络（CNN）、多头自注意力机制以及残差密集神经网络（DenseNet）等技术。通过这些组件的协同作用，CatOpt不仅实现了较高的预测精度，还能够识别哪些氨基酸残基对酶的pH偏好起关键作用。在实验验证中，CatOpt在测试集上的预测准确度达到了R2 = 0.479，均方根误差（RMSE）为0.833，显著优于现有的预测模型，如Seq2pHopt、EpHod和OphPred。这一结果表明，CatOpt在酶pH偏好预测方面具有更高的可靠性。

除了预测精度，CatOpt还具备良好的可解释性。通过分析残差注意力权重，研究人员能够识别出对酶pH偏好起重要作用的氨基酸残基。这种解释能力对于理解酶的结构-功能关系至关重要，因为它可以帮助科学家识别哪些残基在特定pH条件下对催化活性产生显著影响。例如，在酸性偏好酶和中性偏好酶之间，CatOpt能够区分出不同类型的残基（如酸性、碱性、极性和非极性残基）的注意力权重分布，从而揭示了这些残基在酶催化过程中的角色。此外，模型还能够识别出与底物结合位点和催化活性相关的残基，为酶的工程设计提供了理论依据。

在实际应用方面，CatOpt展示了其在酶工程中的潜力。研究人员利用该模型设计了一种单点突变，以增强来自*Pyrococcus horikoshii*的二乙酰基壳二糖苷脱乙酰酶（PhDac）在低pH条件下的催化活性。PhDac用于绿色制造葡萄糖胺（GlcN），其在酸性环境中的活性对于工业应用尤为重要。实验结果表明，通过CatOpt指导设计的突变（如H44C和H44D）使PhDac在pH = 4.5和5.5下的活性提高了约7%。这一成果不仅验证了CatOpt在酶工程中的有效性，也表明其可以作为一种有效的工具，用于设计具有特定pH偏好的酶。

此外，CatOpt在预测点突变对酶pH偏好的影响方面也表现出色。通过对多种酶（如PhDac、BCX、TanBlp和CRZHD）的突变体进行预测，研究人员发现CatOpt能够较为准确地判断突变对酶pH偏好的影响方向。例如，对于PhDac的某些突变，CatOpt预测了pHopt的下降趋势，而对另一些突变则预测了pHopt的上升趋势。这些预测结果与实验数据基本吻合，尽管在某些情况下，数值上的差异仍需进一步验证。通过这种预测能力，CatOpt为酶的理性设计提供了支持，使科学家能够在不进行大量实验的情况下，快速筛选出可能具有理想pH偏好的突变体。

然而，尽管CatOpt在多个方面表现出色，其仍存在一些局限性。首先，训练数据集的不平衡可能影响模型的预测性能。例如，在预测低pH（pHopt < 6）和高pH（pHopt > 8）的酶时，模型的精度相对较低。因此，通过增加这些pH范围的实验数据，可以进一步提升CatOpt的预测能力。其次，CatOpt目前未能充分考虑环境因素（如温度和离子强度）对酶pH偏好的影响。这些因素可能会影响蛋白质的构象变化，从而间接改变酶的催化活性。因此，未来的研究可以结合更多的实验数据，以更好地理解环境条件与酶性能之间的复杂关系。

最后，CatOpt在识别微生物的pH偏好方面也存在一定的挑战。尽管模型能够区分酸性偏好和碱性偏好酶，但在区分中性偏好和酸性偏好微生物时，其表现不够理想。这可能是因为中性偏好微生物中的酶pHopt范围与酸性偏好微生物中的酶pHopt范围存在重叠。因此，需要进一步研究微生物生长环境与酶pH偏好的关系，以提高CatOpt在微生物分类中的准确性。

总体而言，CatOpt作为一种新的深度学习模型，不仅在预测酶的最佳pH值方面表现出色，还具备良好的可解释性，为酶的筛选和工程设计提供了有力的工具。尽管仍存在一些局限性，但其在合成生物学领域的应用前景广阔，有望加速新型酶的发现和优化过程。未来的研究可以进一步完善CatOpt的模型结构，增加训练数据的多样性，并探索其在其他蛋白质功能预测任务中的潜力，从而推动酶科学和生物技术的发展。