活细胞定量监测揭示GIRK2与GIRK1/2通道截然不同且具有高亲和力的Gβγ调控机制

《Nature Communications》：Live-cell quantitative monitoring reveals distinct, high-affinity Gβγ regulations of GIRK2 and GIRK1/2 channels

本研究针对GPCR-Gi/o-GIRK信号通路中Gβγ-GIRK相互作用亲和力及亚基特异性调控的争议，通过活细胞定量蛋白滴定、电生理学、生物化学及分子动力学模拟，揭示了Gy异戊烯化对Gβγ-GIRK相互作用的关键贡献，证实GIRK2与GIRK1/2对Gβγ的亲和力处于低微摩尔级生理范围，并阐明了GIRK1特有的由N端和远端C端结构域构成的Gβγ锚定位点可动态富集Gβγ，从而显著提升GIRK1/2的信号转导效率。

　　

在心脏和神经元中，G蛋白门控内向整流钾通道（GIRK, Kir3）是抑制性G_i/o蛋白偶联受体（GPCR）信号通路的关键效应器，通过超极化细胞膜来降低兴奋性。GIRK通道的 malfunction 与多种神经、心脏及内分泌疾病密切相关。经典的教科书模型描述，GPCR激活后释放G蛋白βγ二聚体（Gβγ），Gβγ直接结合并打开GIRK通道。然而，这一看似清晰的信号通路中，一些核心问题至今悬而未决，争议颇大。其中最关键的争议点在于Gβγ与GIRK相互作用的亲和力究竟有多高？G蛋白与通道之间是否存在预耦合（pre-coupling）以提升信号效率？

早期研究利用异戊烯化（prenylated，一种脂质修饰）的Gβγ，测得解离常数（K_d）在纳摩尔级别（50-800 nM），这与许多其他Gβγ效应器的亲和力相当。然而，近期的研究，特别是基于核磁共振（NMR）和在人工脂质双分子层中重建系统的工作，提出了截然不同的观点：他们使用非异戊烯化的Gβγ，测得Gβγ与GIRK相互作用的亲和力极低，K_d高达250 μM甚至更高。如此低的亲和力意味着，在生理条件下，要有效激活GIRK，质膜上游离Gβγ的密度需要达到惊人的每平方微米1200个分子以上，这远超神经元或心肌细胞中GIRK通道本身的密度（约每平方微米2-10个）。这引发了人们对GPCR-GIRK信号转导效率的质疑：如果没有特殊的机制，如此低效的信号是如何在体内快速、有效地发生的？此外，不同GIRK亚基组成的通道（如GIRK2同源四聚体和GIRK1/2异源四聚体）在基础活性、Gβγ招募能力等方面存在显著差异，但其分子基础尚不完全清楚。

为了解决这些长期存在的争议，由Nathan Dascal、Daniel Yakubovich和Anna Stary-Weinzinger共同领导的一个国际研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究人员提出一个关键假设：Gy亚基的异戊烯化修饰，除了已知的介导Gβγ锚定在质膜上的功能外，是否也直接参与了Gβγ与GIRK的相互作用，从而解释了使用非异戊烯化Gβγ时获得的低亲和力结果？为了在更接近生理环境的活细胞中精确量化Gβγ-GIRK的相互作用，他们发展并运用了一套精密的定量研究方法。

本研究综合运用了多种关键技术方法。核心实验在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中进行，该模型非常适合膜蛋白的定量表达和功能研究。研究人员采用了活细胞定量蛋白滴定技术，通过精确控制Gβγ亚基的表达量，并结合两种独立的校准方法——校准荧光法（CF，利用荧光标记的通道蛋白作为分子标尺）和定量Western blotting（qWB，直接测定分离的质膜样品中的蛋白量）——来精确测定活细胞质膜上Gβγ的表面密度。同时，利用双电极电压钳和细胞贴附式膜片钳技术记录GIRK通道的全细胞电流和单通道开放概率（P_o），从而构建Gβγ剂量依赖的通道激活曲线。此外，研究还包含了体外结合实验（Pull-down assay）以验证蛋白质间直接相互作用，肽阵列扫描以鉴定Gβγ结合位点，以及粗粒化和全原子分子动力学（MD）模拟来从原子水平揭示GIRK1中Gβγ锚定位点的结构和动态相互作用。

脂质修饰对GIRK激活及GIRK-Gβγ相互作用至关重要

研究人员首先验证了Gy亚基异戊烯化的作用。在爪蟾卵母细胞中表达GIRK2通道和毒蕈碱m2受体（m2R），他们发现共表达野生型Gβγ能强烈激活GIRK2电流，而共表达非异戊烯化突变体Gβγ_C68S则既不能激活通道基础电流，也不影响由m2R激动剂乙酰胆碱（ACh）诱发电流。免疫染色实验证实，只有与野生型Gy共表达时，Gβ才能有效富集于巨膜斑（GMP）上。更重要的是，体外Pull-down实验显示，缺乏异戊烯化显著削弱了Gβγ与G蛋白Gα_i3、phosducin以及GIRK1和GIRK2胞质域构建体（G1NC, G2NC）的结合。这表明Gy的异戊烯化直接参与并增强了Gβγ与GIRK的相互作用。

通过校准荧光和定量Western blotting估算质膜Gβγ密度

为了在活细胞中精确定量膜局限的GIRK-Gβγ相互作用，研究团队建立了可靠的蛋白表面密度校准流程。他们使用荧光标记的、已知功能的通道蛋白（如YFP-GIRK1/2和组成性活性的IRK1-YFP）作为分子标尺，将测得的荧光信号转换为膜表面蛋白密度。通过比较两种不同标尺对Gβ·YFP-Gy表面密度的估算结果，验证了校准方法的高度一致性。同时，利用qWB直接测定手动分离的卵母细胞质膜上的Gβ含量，结果与CF法相互印证，确保了后续剂量反应关系研究中Gβγ浓度数据的可靠性。

Gβγ与GIRK2相互作用的亲和力处于低微摩尔范围

通过系统改变Gβ·YFP-Gy的表达量，并在同一卵母细胞中同时测量膜表面YFP-Gy密度和细胞贴附式膜片记录的单通道开放概率（P_o），研究人员构建了Gβγ激活GIRK2的精确剂量反应曲线。曲线呈现高度协同性，初始斜率接近3，表明通道开放需要至少3个Gβγ分子的结合，这与之前提出的WTM模型一致。数据分析显示，GIRK2与Gβγ相互作用的亲和力远高于脂质双层中的测量值。无论采用WTM模型（设协同因子μ=0.3时，K_d ~31 μM；μ=0.44时，K_d ~11 μM）还是Hill方程（K_d ~4 μM）进行拟合，其K_d值均在低微摩尔范围，显著低于此前基于非异戊烯化Gβγ报道的300 μM乃至1.9 mM的K_d值。

GIRK1/2相较于GIRK2具有更高的Gβγ表观亲和力及Gβγ锚定位点的作用

与GIRK2相比，异源四聚体GIRK1/2通道表现出更高的基础活性和对Gβγ更高的表观亲和力。剂量反应曲线显示，激活GIRK1/2达到半最大效应所需的Gβγ密度远低于GIRK2。WTM模型拟合表明，GIRK1/2的K_d（约5.5 μM）比GIRK2（约31 μM）低约6倍。这种差异主要归因于GIRK1亚基上存在的Gβγ锚定位点（docking site）。当研究人员使用缺失GIRK1远端C末端（G1-dCT，该区域对Gβγ招募至关重要）的嵌合通道GIRK1ΔdCT/2时，其Gβγ亲和力显著降低，K_d值比野生型GIRK1/2高4-9倍，且其通道失活动力学与GIRK2相似，在膜片 excision 后快速失活。而GIRK1/2则表现出缓慢且不完全的失活，提示其锚定位点能够动态地维持Gβγ在通道周围的局部浓度。

G1-NT和G1-dCT共同形成Gβγ结合位点并与Gyprenyl相互作用

为了阐明GIRK1上Gβγ锚定位点的分子构成，研究人员进行了肽阵列扫描和分子动力学模拟。肽阵列结果显示，Gβγ不仅能结合已知的位于核心C末端（core-CT）的激活位点（如C1，C3），还能结合GIRK1 N末端（G1-NT，约20-50位氨基酸）和远端C末端（G1-dCT，约390-440和485-501位氨基酸）的多个区段。体外Pull-down实验进一步证实，单独的G1-NT或G1-dCT与Gβγ结合很弱，但将两者融合形成的蛋白质（G1NdCT）则表现出强烈的Gβγ结合能力，表明锚定位点是由G1-NT和G1-dCT共同形成的结构性功能单元。分子动力学模拟结果与实验数据高度吻合，预测了Gβγ与GIRK1多个区段的相互作用，并特别揭示了Gy的异戊烯化尾巴（Gyprenyl）与GIRK1 N末端起始部分存在频繁且特异的相互作用。值得注意的是，模拟还动态地观察到了G1-NT和G1-dCT之间形成一个稳定的结构单元，而删除G1-dCT则会破坏Gyprenyl与G1-NT的相互作用。

本研究通过严谨的活细胞定量分析，有力地证实了Gβγ与GIRK相互作用的真实亲和力处于低微摩尔范围，这一数值更符合生理条件下高效信号转导的要求。研究明确揭示了Gy亚基异戊烯化在促进Gβγ功能及其与GIRK相互作用中的直接作用，澄清了此前因使用非生理性（非异戊烯化）Gβγ而导致的亲和力低估问题。研究进一步阐明了GIRK1/2通道相较于GIRK2具有更高Gβγ表观亲和力的分子机制：GIRK1亚基上由一个独特的、由N端和远端C端结构域共同构成的Gβγ锚定位点，该位点与介导通道开放的Gβγ激活位点在功能和结构上分离，其作用是通过动态的、可逆的预关联（pre-association）方式，局部富集Gβγ（以及可能的Gαβγ异源三聚体）于通道周围，从而显著提高通道微环境中的有效Gβγ浓度。这不仅解释了GIRK1/2的高基础活性，也使其在GPCR激活释放有限量Gβγ时能被更有效地激活。

总之，这项研究解决了G蛋白信号传导领域一个长期存在的关键争议，为理解GPCR-G_i/o-GIRK信号通路的效率和特异性提供了新的定量框架和分子见解。所建立的活细胞定量蛋白滴定方法也为研究其他膜局限的信号传导级联反应提供了有力的工具。研究结果对于深入理解GIRK通道在生理和病理状态下的调控机制，以及针对相关疾病（如心律失常、神经系统疾病）的药物开发具有重要的意义。