通过代谢工程改造大肠杆菌以生产乳-N-新四糖

《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：Metabolic engineering of Escherichia coli for production of lacto-N-neotetraose

乳糖-N-新四糖的高效生产通过基因工程改造大肠杆菌MG1655实现，首先删除lacz、ugd、gcd、nagB、ushA、setA基因，过表达Neisseria meningitidis的lgtA和lgtB基因，构建工程菌株WY011/pC-A/pR-B，初始产量达1.102 g/L。通过优化限速基因过表达、表达载体筛选及核糖体结合位点强度，产量提升至2.634 g/L。进一步优化发酵参数使产量增至3.533 g/L，结合甘油、乳糖和半乳糖混合底物的全细胞催化工艺，产量突破10.845 g/L，创小规模系统中新高。最终通过2-L生物反应器的分批补料发酵，实现16.202 g/L的突破性产量。

　　

摘要

乳-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose）是一种在人乳中含量丰富的寡糖，具有多种生理功能。在本研究中，使用大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655作为生产乳-N-新四糖的底盘菌株。首先，从MG1655中删除了lacz、ugd、gcd、nagB、ushA和setA基因，并过表达了脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）中的lgtA和lgtB基因，这两个基因分别编码β-1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶（β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase）和β-1,4-半乳糖转移酶（β-1,4-galactosyltransferase），最终得到的WY011/pC-A/pR-B菌株能够产生1.102克/升的乳-N-新四糖。随后，通过对限速基因的表达进行优化、筛选合适的表达载体以及调整核糖体结合位点的强度，WY011/pR-BEA1R菌株的产量提高到了2.634克/升。进一步优化发酵参数后，工程菌株WY011/pR-BEA1R的产量达到了3.533克/升；利用该菌株以及甘油、乳糖和半乳糖作为混合底物开发的全细胞催化工艺将产量进一步提升至10.845克/升，这是迄今为止在小规模系统中报道的最高产量。最终，在2升生物反应器中采用连续补料发酵（fed-batch fermentation）的方式，WY011/pR-BEA1R菌株的产量达到了16.202克/升。

乳-N-新四糖是一种在人乳中含量丰富的寡糖，具有多种生理功能。在本研究中，使用大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655作为生产乳-N-新四糖的底盘菌株。首先，从MG1655中删除了lacz、ugd、gcd、nagB、ushA和setA基因，并过表达了脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）中的lgtA和lgtB基因，这两个基因分别编码β-1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶（β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase）和β-1,4-半乳糖转移酶（β-1,4-galactosyltransferase），最终得到的WY011/pC-A/pR-B菌株能够产生1.102克/升的乳-N-新四糖。随后，通过对限速基因的表达进行优化、筛选合适的表达载体以及调整核糖体结合位点的强度，WY011/pR-BEA1R菌株的产量提高到了2.634克/升。进一步优化发酵参数后，工程菌株WY011/pR-BEA1R的产量达到了3.533克/升；利用该菌株以及甘油、乳糖和半乳糖作为混合底物开发的全细胞催化工艺将产量进一步提升至10.845克/升，这是迄今为止在小规模系统中报道的最高产量。最终，在2升生物反应器中采用连续补料发酵（fed-batch fermentation）的方式，WY011/pR-BEA1R菌株的产量达到了16.202克/升。