氯菊酯通过激活Nav1.6钠通道及升高谷氨酸水平诱导癫痫易感性的跨物种研究

《Communications Biology》：Permethrin induces epileptic susceptibility via activation of Na+ channels and rise in glutamate

本期推荐一项发表于《Communications Biology》的重要研究。为解决农药暴露与癫痫发病机制关联不明的科学问题，研究人员开展氯菊酯(PM)神经毒性机制研究，发现环境相关浓度PM通过激活电压门控钠通道（尤其Nav1.6亚型）引起谷氨酸过度释放，破坏神经环路兴奋/抑制平衡，导致斑马鱼和小鼠出现癫痫样症状。该研究首次揭示PM通过Nav1.6-Glu通路诱发癫痫的跨物种保守机制，为农药神经毒性防治提供新靶点。

　　

随着拟除虫菊酯类农药在农业和居家环境中的广泛使用，其残留物在环境中的检出率持续攀升。流行病学研究显示，职业性接触农药人群的癫痫患病率显著增加，但具体作用机制尚未明确。氯菊酯作为最常检测到的拟除虫菊酯类杀虫剂，其神经毒性效应尤其引人关注。癫痫作为全球最常见的严重脑部疾病之一，影响约6500万人，其中约60%病例病因不明，环境因素日益受到重视。在此背景下，揭示氯菊酯与癫痫发病的关联机制，对公共卫生和临床防治具有重要意义。

研究人员通过跨物种研究策略，利用斑马鱼和小鼠模型，结合行为学分析、电生理记录和分子生物学技术，系统探讨了氯菊酯的神经毒性效应。研究发现，环境相关浓度（20-500 μg L^-1）的氯菊酯急性暴露可诱导斑马鱼胚胎出现漩涡样游动、阵挛样抽搐等癫痫样行为，并伴随神经元钙活动增强。慢性暴露则引起成年斑马鱼焦虑样行为、神经发生减少和胶质细胞增生。更重要的是，氯菊酯预处理显著提高小鼠对戊四氮(PTZ)和海人酸(KA)诱导癫痫的敏感性，降低发作阈值，加重发作程度。

机制研究表明，氯菊酯通过激活电压门控钠通道，特别是Nav1.6亚型，引起谷氨酸能神经元过度兴奋，导致谷氨酸释放增加，破坏神经环路的兴奋/抑制平衡。使用钠通道阻断剂卡马西平(CBZ)或谷氨酸受体拮抗剂可显著缓解氯菊酯诱导的癫痫样症状。全细胞膜片钳记录进一步证实，氯菊酯使钠通道激活曲线发生超极化偏移，降低激活阈值，增强神经元兴奋性。

主要技术方法包括：1）斑马鱼癫痫模型构建与行为分析；2）小鼠PTZ/KA急性癫痫和慢性点燃模型；3）在体钙成像技术记录神经元活动；4）全细胞膜片钳记录神经元电活动；5）RNA测序与分子生物学分析；6）免疫荧光染色与细胞计数。实验使用野生型AB系斑马鱼和C57BL/6J小鼠，所有动物 procedures 均通过伦理审查。

氯菊酯引起斑马鱼胚胎漩涡样游动、阵挛样抽搐和神经元过度兴奋

研究人员将斑马鱼胚胎暴露于环境相关浓度的氯菊酯（20-500 μg L^-1）70小时后，发现500 μg L^-1处理组胚胎出现方向感丧失的快速漩涡样游动，伴随尾部对称性摆动频率增加（10.60±0.40次/分钟），最大摆动幅度达103.30±10.27°。转基因斑马鱼（Tg(HuC:GCaMP6s)）在体钙成像显示，氯菊酯处理组中脑神经元钙信号波动幅度呈浓度依赖性增加，最高达对照组的4.52倍，表明神经元兴奋性显著增强。

长期氯菊酯暴露引起幼鱼额外眼球震颤和感觉反应受损

5 dpf斑马鱼幼鱼在500 μg L^-1氯菊酯暴露后出现频繁抽搐（16.00±0.98次/分钟）和增强的尾部摆动幅度（119.10±5.58°）。值得注意的是，50 μg L^-1以上浓度处理组出现水平共轭性眼球震颤，频率随浓度增加而升高（500 μg L^-1组达9.89±0.68次/分钟），这与临床癫痫病例中观察到的眼球震颤相似，但在PTZ处理组中未见此现象。光周期刺激测试显示，高浓度氯菊酯处理组幼鱼对光暗转换的反应距离和速度显著降低。

长期氯菊酯暴露导致幼鱼神经发生减少和胶质细胞增生

免疫荧光分析发现，氯菊酯暴露后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)+信号强度显著增加，而神经分化因子1(Neurod1)-GFP+和神经元核抗原(NeuN)+神经元数量呈浓度依赖性减少。特别是vglut2a+兴奋性谷氨酸能神经元数量增加，而gad1b-mCherry+γ-氨基丁酸(GABA)能神经元无显著变化。Sox2标记的神经干祖细胞数量减少，增殖神经元（HuC+EdU+）计数明显下降，但凋亡细胞无变化。

长期氯菊酯暴露导致成年斑马鱼焦虑样症状

连续暴露于50 μg L^-1氯菊酯6个月的斑马鱼在开阔场测试中表现出靠近墙壁的趋触性行为，中心区运动距离减少27.93%。明暗偏好测试显示，处理组在暗区的运动距离和速度分别增加49.77%和36.80%。社会偏好测试中，处理组在远离社交刺激区域停留时间增加16.32-19.35倍。脑组织分析显示GFAP+信号显著增加，NeuN+信号减少，与幼鱼结果一致。

氯菊酯诱导钠离子通道激活

RNA测序分析发现，氯菊酯处理组中跨膜运输、钠离子运输和细胞内钠离子稳态相关基因显著富集。使用四种临床抗癫痫药物（托吡酯、丙戊酸钠、卡马西平、乙琥胺）干预后发现，钠通道阻断剂（托吡酯、丙戊酸钠、卡马西平）显著缓解氯菊酯诱导的运动距离增加、抽搐频率和神经元活动增强，而钙通道阻断剂乙琥胺效果有限。卡马西平处理使神经发生指标恢复至接近对照组水平。

-1氯菊酯处理组共同富集的GO和KEGG术语；c 3 dpf胚胎总运动距离；d,e 5 dpf幼鱼抽搐频率和眼动频率；f,g GCaMP6s+信号代表图像和波动范围；h,i Neurod1-GFP+信号图像和定量'>

钠通道激活导致癫痫样症状

使用钠通道激活剂藜芦定(6-12 μg mL^-1)处理斑马鱼胚胎，可模拟氯菊酯诱导的漩涡样游动和短暂阵挛样行为，45.83%-91.67%胚胎出现阶段性运动增加，GCaMP6s+细胞波动幅度显著高于对照组，证实钠通道激活在癫痫样症状中的关键作用。

靶向钠通道缓解氯菊酯暴露诱导的癫痫样症状

研究人员使用甲丙氨酯（靶向Nav1.4）、氟卡尼乙酸酯（靶向Nav1.5）和SYM2206（靶向Nav1.6）处理斑马鱼胚胎，发现Nav1.6抑制剂使抽搐频率降低51.14%，眼动频率降低27.59%，并部分恢复神经元数量（11.73%）。scn8aa基因敲除斑马鱼（crispant）在氯菊酯暴露后抽搐和眼动频率显著降低，运动距离和速度分别减少60.71%和64.85%，表明Nav1.6在氯菊酯诱导的癫痫样症状中起核心作用。

crispant幼鱼抽搐和眼动频率'>

氯菊酯通过激活钠通道导致谷氨酸水平升高

氯菊酯暴露使斑马鱼幼鱼和成年鱼脑内谷氨酸浓度分别增加23.36%和24.16%。谷氨酸受体和转运体基因（grin1a、gria4a、vglut2a等）表达显著上调。钠通道激活剂藜芦定处理可模拟这种基因表达变化。使用谷氨酸受体抑制剂D-AP5和CNQX处理，使抽搐和眼动频率降低20-50%，GABA受体激动剂巴氯芬处理使频率降低59.60%和51.17%，表明恢复兴奋/抑制平衡可缓解症状。

氯菊酯加剧小鼠癫痫易感性和发作严重程度

小鼠预暴露于30%和50%半致死剂量(LD₅₀)氯菊酯10天后，在PTZ诱导的急性癫痫模型中，首次全身性发作潜伏期分别缩短至55.00±2.55和50.71±3.34分钟（对照组63.40±4.34分钟），发作发生率显著提高。在PTZ慢性点燃模型中，氯菊酯预处理组发作等级更高。KA诱导的癫痫模型中，氯菊酯预处理组每日自发性复发癫痫发作次数增加21%-64.19%。全细胞膜片钳记录显示，氯菊酯处理使初级神经元动作电位发放频率显著增加。

氯菊酯通过Nav1.6激活增强小鼠癫痫易感性

qRT-PCR和免疫荧光显示，氯菊酯处理组小鼠海马区Scn8a（编码Nav1.6）表达显著上调，Nav1.6蛋白水平增加。使用钠通道阻断剂ICA-121431和SYM2206预处理小鼠5天，可显著延迟PTZ诱导的癫痫发作潜伏期（增加30%-35%），降低全身性发作发生率。全细胞膜片钳记录发现，氯菊酯处理使钠电流-电压关系曲线发生超极化偏移，峰值电流密度增加（-583.6±48.44 pA vs 对照组-316.2±71.99 pA），半激活电压降低，表明钠通道激活阈值降低。

1/2)；l 稳态失活曲线；m 半失活电压(V_1/2)'>

氯菊酯增强海马神经元突触前谷氨酸释放

自发性兴奋性突触后电流(sEPSCs)记录显示，氯菊酯处理组频率增加4.81倍，振幅也显著增加。微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)频率增加3.13倍，但振幅无变化，表明氯菊酯通过增强突触前谷氨酸释放促进兴奋性突触传递。谷氨酸传感荧光报告基因(iGluSnFR)成像显示，氯菊酯处理神经元荧光强度显著增加，突触谷氨酸释放频率升高。海马区谷氨酸含量增加6.10%，谷氨酸转运体EAAT1表达增加35.28%，星形胶质细胞标志物GFAP表达增加，表明谷氨酸水平升高主要源于释放增加而非摄取受损。

本研究通过跨物种实验证实，环境相关浓度氯菊酯暴露通过激活电压门控钠通道（特别是Nav1.6亚型），引起谷氨酸过度释放，破坏神经环路兴奋/抑制平衡，导致癫痫易感性增加。该发现不仅揭示了农药暴露与癫痫关联的分子机制，也为防治农药相关神经系统疾病提供了新靶点。钠通道和神经递质平衡可能成为抗氯菊酯暴露的保护性靶标，对制定农药安全使用标准和癫痫防治策略具有重要指导意义。