基于荧光光谱与分子对接的小麦叶酸衍生物与胰蛋白酶相互作用机制研究及其营养强化意义

《Scientific Reports》：Fluorescence spectroscopy combined with molecular docking to study the interaction between folic acid derivatives from wheat grains and bovine trypsin

本研究针对叶酸在人体吸收过程中与消化酶相互作用机制不清的问题，通过荧光光谱与分子对接技术，系统阐明了四种小麦源叶酸衍生物（THF、5-CH3-THF、5-CHO-THF、5,10-CH2-THF）与牛胰蛋白酶的结合特性。研究发现5-CHO-THF通过氢键和范德华力展现最强结合能力，为叶酸强化主粮作物育种提供了关键理论依据。

　　

叶酸作为细胞生长繁殖必需的维生素，在预防新生儿神经管缺陷（NTD）和心血管疾病方面具有重要作用。然而人体无法自主合成叶酸，必须通过膳食摄入。小麦作为主要粮食作物，其籽粒中含有多种叶酸衍生物，但这些活性成分在消化过程中与蛋白酶相互作用的机制尚不明确，制约了叶酸强化作物育种的发展。

为揭示叶酸衍生物与消化酶的相互作用机制，研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，采用荧光光谱和分子对接技术，系统研究了四种主要小麦叶酸衍生物——四氢叶酸（THF）、5-甲基四氢叶酸（5-CH₃-THF）、5-甲酰基四氢叶酸（5-CHO-THF）和5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH₂-THF）与牛胰蛋白酶的相互作用。

研究团队运用荧光淬灭分析、结合常数计算、热力学参数测定和分子对接等关键技术方法，重点关注了叶酸衍生物对胰蛋白酶内在荧光的淬灭机制、结合亲和力、作用力类型以及分子层面的相互作用细节。

3.2. 叶酸衍生物与胰蛋白酶相互作用的荧光光谱分析

通过检测295 nm激发波长下的荧光发射光谱，发现四种叶酸衍生物均能浓度依赖性地淬灭胰蛋白酶的内在荧光，并引起发射峰红移。其中5-CHO-THF诱导的最大发射峰红移达9 nm，表明其可能引起胰蛋白酶构象的显著变化。

3.3. 叶酸衍生物对胰蛋白酶的荧光淬灭机制

Stern-Volmer方程分析显示，THF和5-CH₃-THF遵循动态淬灭机制，而5-CHO-THF和5,10-CH₂-THF则表现为静态-动态混合淬灭模式。

3.4. 叶酸衍生物与胰蛋白酶的结合常数和结合位点数

结合常数K_a计算表明，所有衍生物与胰蛋白酶均具有较强的结合能力（K_a > 10³），其中5-CHO-THF在37°C时的结合常数高达2.76×10⁷ L·mol^-1，显著高于其他衍生物。

3.5. 叶酸衍生物与胰蛋白酶结合的热力学参数

热力学分析揭示，THF和5-CH₃-THF与胰蛋白酶的相互作用（ΔH>0，ΔS>0）主要由疏水作用驱动，而5-CHO-THF和5,10-CH₂-THF（ΔH<0，ΔS<0）则主要通过氢键和范德华力结合。

3.6. 叶酸衍生物与胰蛋白酶的结合距离

基于F?rster共振能量转移理论计算显示，所有叶酸衍生物与胰蛋白酶色氨酸残基的结合距离均小于7 nm，符合非辐射能量转移的条件。

3.7. 分子对接结果

分子对接进一步证实了光谱分析结果，显示5-CHO-THF与胰蛋白酶形成9个氢键，远多于其他衍生物，这解释了其更强的结合能力。所有衍生物均位于胰蛋白酶的疏水口袋中，但相互作用的氨基酸残基存在差异。

3.8. FTIR分析

傅里叶变换红外光谱分析表明，5-CHO-THF通过醛基与赖氨酸残基形成希夫碱，显著改变胰蛋白酶的二级结构，而其他衍生物引起的构象变化相对较小。

研究结论表明，不同叶酸衍生物与胰蛋白酶的相互作用机制存在显著差异，特别是5-CHO-THF因其醛基带来的极性增强，表现出最强的结合亲和力。这一发现为理解叶酸在人体内的消化吸收过程提供了分子层面的见解，也为培育高叶酸小麦品种提供了重要理论支撑。该研究不仅阐明了叶酸衍生物与消化酶的相互作用机制，还为叶酸强化食品的开发提供了科学依据，对改善人群叶酸营养状况、预防相关疾病具有重要意义。