《Cellular Signalling》：Oscillatory shear stress mediates endothelial cell senescence by regulating endoplasmic reticulum stress through HMOX1
编辑推荐：
振荡剪切应力（OSS）通过激活内质网应激（ERS）和HMOX1信号通路诱导内皮细胞衰老，并促进动脉粥样硬化（AS）发展。实验证实HMOX1是OSS介导的ERS相关衰老的核心枢纽基因，抑制HMOX1可缓解ERS标志物（ATF4、IRE1α、BIP）及衰老标志物（p53、p21）的异常表达，联合抑制ers和hmox1基因可逆转OSS诱导的衰老表型。本研究揭示了OSS-HMOX1-ERS轴在AS中的调控机制，为靶向治疗内皮细胞衰老提供了新思路。
康云楠|张晓云|李红|关秀梅|陈浩|齐子月|孙明瑶|程敏|崔晓东
中国山东省第二医科大学基础医学科学学院慢性疾病与干细胞治疗基础研究潍坊重点实验室，潍坊261053
摘要
振荡剪切应力（OSS）可诱导内皮细胞（ECs）衰老，从而推动动脉粥样硬化（AS）的发展，而内质网应激（ERS）的作用尚不明确。OSS通过增加SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的染色水平以及上调p53、p21和p16的表达水平，以及衰老相关分泌表型（SASP），来诱导ECs的衰老。SASP因子IL-1β、MIP-1α和TNFα表明p53/p21通路的激活。转录组分析（GSE276195）显示OSS激活了ERS，富集了相关信号通路，并上调了ATF4、IRE1α和BIP等ERS核心标志物的表达水平。使用4-PBA显著抑制ERS后，OSS诱导的衰老现象得到缓解。综合WGCNA和PPI分析确定了HMOX1作为一个核心枢纽基因，这一结论通过体内和体外实验得到了验证。HMOX1在OSS处理后表达增加，并与ERS基因共表达。通过使用Znpp抑制HMOX1的表达，我们发现HMOX1的抑制减少了OSS诱导的ERS标志物（BIP和IRE1α）和衰老标志物（p53和p21）的上调；然而，与放线菌素T联合处理及HMOX1沉默则恢复了这些上调的水平，进一步证明了HMOX1在介导ERS诱导的衰老中的重要性。本研究阐明了OSS-HMOX1-ERS轴在调控ECs衰老中的作用，并表明HMOX1介导的ERS在AS发展中起着关键作用。
引言
动脉粥样硬化（AS）是一种与年龄相关的慢性炎症过程，会导致多种心血管疾病，是全球发病率和死亡率的主要原因[1]。振荡剪切应力（OSS）经常发生在动脉分叉和弯曲处，在AS的早期和发展阶段起着重要作用[2]。内皮细胞（ECs）位于血管内壁，对血流产生的血流动力学压力和应力反应强烈，其位置使它们处于特定的血流动力学微环境中。直血管经历连续或层流剪切应力（LSS），这是维持内皮细胞稳态和血管完整性的最重要因素。LSS具有抗炎作用，可防止细胞增殖和凋亡，并抑制单核细胞附着于血管内皮[3],[4],[5]。然而，OSS可通过氧化应激损伤ECs，从而影响抗动脉粥样硬化反应（抗动脉粥样硬化、促炎或抗血栓形成）。位于血管分支或弯曲处的ECs（如颈动脉分叉或主动脉弓）会受到这些部位血流湍流产生的OSS的影响。这些现象会对ECs造成损害，导致其衰老并产生衰老相关分泌表型（SASP）[6,7]。大量研究表明，内皮细胞衰老会损害内皮依赖的血管舒张、血管生成和屏障功能[8],[9],[10],[11]。因此，OSS诱导的内皮细胞衰老在AS的发生和发展中起着重要作用。
细胞衰老是指细胞周期永久性停滞及功能随之下降的状态。衰老细胞会分泌许多生物活性分子，称为SASP[12]。细胞衰老会导致生物体衰老并加速与衰老相关的疾病。最近的研究提出，血管系统在衰老过程中起着“前线组织”的作用[13]。特别是，衰老的内皮细胞是AS发展的主要原因[14,15]。衰老的内皮细胞通过其对血管屏障功能的不良影响，在AS发展中起着重要作用[11]。此外，衰老的内皮细胞会分泌多种SASP因子，包括炎症细胞因子、基质蛋白、蛋白酶和生长因子，这些都会导致AS[7,16]。因此，消除衰老的内皮细胞对治疗与年龄相关的AS具有显著益处；然而，目前尚未找到有效的方法来避免内皮细胞衰老。
内质网应激（ERS）与细胞衰老之间的密切关联已得到充分证实。内质网功能受损会导致错误折叠蛋白质的积累，从而触发未折叠蛋白反应（UPR）的激活。在健康细胞中，UPR的激活具有细胞保护作用[17]。然而，晚年长期存在的ERS会同时刺激衰老和凋亡。此外，ERS诱导因素常常还会引发其他类型的细胞应激（如炎症、氧化应激和线粒体应激），最终促进SASP的形成[18]。因此，减少或消除ERS被提出作为一种抑制细胞衰老的方法。然而，目前尚不清楚ERS是否参与OSS诱导的内皮细胞衰老。
在本研究中，我们发现人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）的OSS诱导衰老是由ERS介导的。文献证实HMOX1是一种与血流动力学和氧化应激密切相关的应激蛋白[19]。从机制上讲，我们发现抑制HMOX1表达可以减轻ERS，从而缓解内皮细胞衰老。我们的研究表明，针对ERS是治疗内皮细胞衰老相关疾病的一种有前景的方法。
实验部分
细胞培养与处理
HUVECs在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco，货号C11995500BT，美国）中培养，该培养基添加了10%胎牛血清（FBS，BIOEXPLORER，货号BA1650–179，美国）和0.1%氨苄西林。细胞在37°C恒定温度和5%二氧化碳条件下培养。当细胞密度达到90%时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化。待细胞完全脱离后，用完全培养基终止消化过程。通过轻柔吸管操作制备单细胞悬液。
OSS诱导内皮细胞衰老
衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是经典的细胞衰老生物标志物。此外，p53和p21细胞周期蛋白也是常见的细胞衰老标志物[23]。为了研究OSS对HUVECs衰老的影响，我们使用SA-β-gal染色评估了细胞衰老，并通过Western blot检测了p53和p21的蛋白质表达。SA-β-gal染色显示，OSS处理的HUVECs中阳性细胞数量显著增加（图1A）。
讨论
AS主要发生在暴露于振荡剪切应力（OSS）的血管区域，在这些区域，内皮细胞衰老是血管功能障碍的起始因素，通过破坏血管稳态和促进炎症加速斑块形成。尽管血流动力学与内皮细胞衰老之间的关联已有充分记录，但OSS诱导的内皮细胞衰老的分子机制尚未完全明了[25]。本研究通过细胞实验进一步探讨了这一过程。
作者贡献声明
康云楠：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，方法学研究，实验设计，数据分析，概念构建。张晓云：方法学研究，实验设计，数据分析，概念构建。李红：方法学研究，实验设计，数据分析，概念构建。关秀梅：方法学研究，实验设计，数据分析，概念构建。陈浩：方法学研究，实验设计，数据分析
资助
作者声明本研究、作者身份及/或文章发表获得了财政支持。本工作得到了山东省第二医科大学教师博士启动项目（项目编号2023GBZ002）、山东省自然科学基金（项目编号ZR2020MH020）和国家自然科学基金（项目编号81700406）的支持。
作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：
致谢
我们感谢所有为这项研究提供宝贵支持和帮助的人士。同时，我们也感谢GEO（
GSE276195）网络提供的数据支持。
