靶向MCL-1清除衰老细胞以减轻马兜铃酸肾病肾纤维化

《Cell Death & Disease》：Inhibition of MCL-1 to eliminate senescent cells and mitigate renal fibrosis in aristolochic acid nephropathy

本研究聚焦于急性肾损伤（AKI）向慢性肾脏病（CKD）转变过程中肾小管上皮细胞（TEC）衰老的作用难题。研究人员利用马兜铃酸肾病（AAN）模型，发现衰老TEC通过上调MCL-1等抗凋亡蛋白获得生存优势。研究证实，早期应用MCL-1特异性抑制剂UMI-77可有效清除衰老细胞并减轻纤维化，而靶向BCL-2/BCL-xL的senolytic药物ABT-263则无效甚至加重纤维化。该研究为精准senolytic疗法提供了新靶点，强调了干预时机的重要性。

　　

在肾脏病研究领域，一个令人困惑的谜题长期存在：为什么一次看似可恢复的急性肾损伤（AKI），常常会不可逆转地进展为慢性肾脏病（CKD），最终导致肾功能衰竭？科学家们逐渐将目光聚焦于一种特殊的细胞状态——细胞衰老。衰老细胞如同体内“僵尸细胞”，它们停止分裂，但却异常活跃地分泌各种有害因子，破坏周围组织环境。然而，这些衰老细胞在肾脏中究竟扮演何种角色？它们如何逃避正常的死亡程序而长期存活？更重要的是，能否精准地清除它们以阻止疾病进展？这些问题一直是该领域的研究热点和难点。

为了解开这些谜团，由Peng Gao、Schrodinger Cenatus、Nathalie Henley、Vincent Pichette、Frédérick A. Mallette、Jonatan Barrera-Chimal和Casimiro Gerarducci组成的研究团队在《Cell Death & Disease》上发表了一项重要研究。他们选择了一种独特的疾病模型——马兜铃酸肾病（AAN），这种肾病由马兜铃酸（AAI）引起，以其明确的急性肾小管损伤和进行性纤维化为特征，是研究AKI向CKD转变的理想模型。

研究人员发现，AAI进入体内后，主要在肾小管上皮细胞（TEC）中代谢活化，形成DNA加合物，引发严重的DNA损伤。细胞为了应对这种危机，会启动一套复杂的信号网络，即DNA损伤反应（DDR）。然而，当损伤过于严重无法修复时，细胞便会启动衰老程序，进入一种不可逆的细胞周期停滞状态。这些衰老的TEC不仅自身功能失常，还会通过释放一系列被称为衰老相关分泌表型（SASP）的炎性因子和促纤维化因子，如同“坏邻居”一样，毒害周围的健康细胞，特别是促使成纤维细胞活化，产生过多的细胞外基质，最终导致肾脏瘢痕化，即肾纤维化。

更棘手的是，这些衰老细胞非常“狡猾”，它们会高表达一类名为BCL-2家族的抗凋亡蛋白（如BCL-2, BCL-xL, MCL-1），从而获得强大的生存能力，抵抗正常的细胞凋亡过程。这也就是为什么常规的细胞死亡信号难以清除它们。目前，一类旨在选择性清除衰老细胞的药物，即senolytics，已成为抗衰老和治疗年龄相关疾病的研究前沿。其中，ABT-263（Navitoclax）是一种能同时抑制BCL-2和BCL-xL的senolytic药物，在部分研究中显示出潜力，但其在肾脏疾病中的效果却不一致，有时甚至有害。这提示我们，不同组织、不同病因导致的衰老细胞，其赖以生存的“保护伞”可能各不相同。因此，寻找更精准、更有效的靶点至关重要。

本研究的核心突破在于，通过精密的实验设计，研究人员鉴定出MCL-1是AAN模型中衰老TEC的一个关键且特异性的生存依赖蛋白，并证实早期靶向MCL-1能有效清除衰老细胞，延缓肾纤维化进程，为开发更安全的肾脏抗纤维化疗法提供了新的理论依据和策略。

为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究主体采用了马兜铃酸I（AAI）诱导的小鼠马兜铃酸肾病（AAN）模型以模拟AKI-to-CKD进程。体外实验使用人肾近曲小管上皮细胞系（HK-2细胞）和小鼠原代肾小管上皮细胞（mTEC）进行机制探讨。技术层面包括：蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色用于检测蛋白表达与定位；SA-β-gal染色用于鉴定细胞衰老；单核RNA测序（snRNA-Seq）用于在单细胞分辨率下分析细胞群体和基因表达谱；流式细胞术用于分析细胞周期；以及条件培养基（CM）实验用于评估衰老细胞分泌组的功能影响。药理学干预则使用了MCL-1特异性抑制剂UMI-77和BCL-2/BCL-xL抑制剂ABT-263。

研究结果

AAI诱导的DNA损伤主要累积于近端肾小管上皮细胞并激活DDR通路

研究人员首先在小鼠AAN模型中证实，AAI注射后，肾脏中代表DNA双链断裂的标志物γH2AX水平随时间推移而升高，同时DNA修复关键蛋白PARP1减少，提示DNA损伤持续存在且修复能力受损。免疫荧光染色显示，磷酸化的ATM（p-ATM）和CHK2（p-CHK2）等DDR信号分子与γH2AX焦点共定位，表明ATM-CHK2通路被激活。更重要的是，这些DNA损伤信号主要出现在表达肾损伤分子1（KIM-1）的受损近端小管中，而非表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的远端小管，表明AAI的损伤作用具有细胞特异性。

p21和p16介导的细胞衰老在AAN模型中依次出现并空间分布不同

SA-β-gal染色显示，AAI注射后第7天起，肾脏中衰老细胞显著增加。分子水平上，细胞周期抑制蛋白p53和p21在早期（第3天）即迅速上调，而p16的表达则在后期（第14、21天）更为明显。免疫荧光共定位分析揭示，p21主要与KIM-1阳性的近端小管共定位，而p16则在KIM-1+的近端小管和NGAL+的远端小管中均有表达。这表明p21驱动的衰老是近端小管对急性DNA损伤的早期反应，而p16可能参与维持长期的衰老状态，并且衰老表型可能通过旁分泌效应扩展至远端小管。

衰老的肾小管上皮细胞上调抗凋亡蛋白，尤其依赖MCL-1

蛋白质印迹和免疫荧光显示，在AAN小鼠肾脏中，抗凋亡蛋白MCL-1、BCL-2和BCL-xL的表达均有所增加，且与KIM-1阳性小管共定位。单核RNA测序（snRNA-Seq）数据进一步在单细胞水平确认，存在一个独特的KIM-1阳性、高表达衰老标志物（Cdkn1a/p21, Cdkn2a/p16）和SASP因子的衰老TEC群体。关键的是，虽然BCL-2和BCL-xL在衰老细胞中高表达，但它们在非衰老细胞中也普遍存在。而MCL-1（Mcl1）基因则在衰老TEC群体中特异性富集，提示靶向MCL-1可能具有更好的选择性。

AAI在体外直接诱导人肾小管上皮细胞衰老并激活SASP

在HK-2细胞中，AAI处理成功诱导了细胞周期停滞、SA-β-gal活性增加、DDR通路激活以及p53/p21和p16/Rb通路的持续活化，证实AAI可直接引发TEC衰老。这些衰老细胞还表现出核因子κB（NF-κB）信号通路激活，并分泌高水平的SASP因子（如IL-6, IL-8, PAI-1）。功能实验表明，衰老HK-2细胞的条件培养基能诱导正常的HK-2细胞发生上皮-间质转化（EMT），并促进肾脏成纤维细胞向产胶原的肌成纤维细胞转化（FMT），这直接证明了衰老细胞通过其分泌组驱动纤维化进程。

药理学抑制MCL-1可特异性清除衰老细胞并减轻肾纤维化

体外实验表明，衰老的HK-2细胞和原代mTEC对MCL-1抑制剂UMI-77的敏感性显著高于增殖中的细胞。在体实验中，在衰老细胞出现后（AAI注射后第7天起）早期给予UMI-77，能显著减少肾脏中衰老细胞（SA-β-gal+, γH2AX+, p21+）的数量，降低肾小管损伤标志物KIM-1的表达，并明显减轻肾间质纤维化（胶原沉积和α-SMA+肌成纤维细胞减少）。然而，如果在疾病慢性期（第21天起）才开始治疗，UMI-77的效果则大打折扣。令人惊讶的是，使用senolytic药物ABT-263进行治疗，不仅未能清除衰老细胞、改善纤维化，反而加重了肾脏损伤和纤维化程度。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了马兜铃酸肾病中肾小管上皮细胞衰老的动力学特征、分子机制及其在肾纤维化中的核心作用。研究的主要结论是：AAI通过引起DNA损伤，主要在近端肾小管上皮细胞中诱发了依赖于MCL-1抗凋亡蛋白存活的衰老细胞群体；这些细胞通过分泌SASP促进纤维化；早期而非晚期应用MCL-1特异性抑制剂UMI-77，能有效且选择性地清除这些衰老细胞，从而缓解肾纤维化。

该研究的重大意义在于：首先，它明确了MCL-1是肾脏特定疾病模型中衰老TEC的一个关键“阿喀琉斯之踵”，为开发精准的senolytic疗法提供了新的特异性靶点，避免了靶向BCL-2/BCL-xL可能带来的脱靶效应和不良反应。其次，研究强调了治疗时机的重要性，指出在衰老细胞群落建立初期进行干预是成功的关键，这为临床转化中的治疗方案设计提供了重要参考。最后，研究采用的AAN模型以及结合snRNA-Seq等多组学技术的方法，为在复杂肾脏环境中解析特定细胞类型的衰老提供了强有力的工具和范式。

总之，这项研究不仅深化了对肾脏疾病中细胞衰老机制的理解，更重要的是，它提出了一种通过精准靶向MCL-1进行早期干预以阻止AKI向CKD转变的新策略，为抗击肾纤维化开辟了一条充满希望的新途径。