冷冻关联光-X射线-电子显微镜（cryo-CLXEM）：利用冷冻软X射线断层成像弥补冷冻CLEM分辨率间隙的新策略

《Communications Biology》：Cryo-CLXEM introduces cryo-SXT to bridge the resolution gap in cryo-CLEM

本刊推荐：研究人员针对冷冻关联光电子显微镜（cryo-CLEM）中冷冻可见光荧光显微镜（cryo-VLFM）与冷冻电子断层扫描（cryo-ET）之间存在分辨率鸿沟的难题，开发了集成冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）的三模态关联工作流程cryo-CLXEM。该方案通过cryo-SXT提供30 nm分辨率的3D细胞上下文信息，有效指导聚焦离子束（FIB）减薄定位，使冷冻电子断层扫描在总辐射剂量控制下仍能达到约5 nm分辨率。该技术为复杂生物系统的多尺度结构研究提供了新的成像范式。

　　

在细胞生物学研究领域，科学家一直致力于在接近自然状态的条件下观察细胞内部精细结构。冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）作为当前结构生物学的重要技术，能够在分子分辨率水平揭示细胞器的三维结构。然而，要实现高质量cryo-ET数据采集，样品必须被减薄至200纳米以下，这一过程通常通过冷冻聚焦离子束（cryo-Focused Ion Beam, cryo-FIB）研磨完成。

问题的关键在于如何精准定位需要研究的细胞区域。目前主流的冷冻关联光电子显微镜（cryo-correlative light and electron microscopy, cryo-CLEM）技术依赖冷冻可见光荧光显微镜（cryo-visible light fluorescent microscopy, cryo-VLFM）进行靶点定位，但该技术存在明显局限：横向分辨率仅约350纳米，轴向分辨率超过1微米，远远无法满足对小于200纳米结构的精确定位需求。更棘手的是，cryo-FIB研磨过程会移除大部分细胞材料，导致宝贵的细胞上下文信息永久丢失。

为解决这一技术瓶颈，由Johannes Groen领衔的国际研究团队在《Communications Biology》上发表了创新性研究成果，提出了冷冻关联光-X射线-电子显微镜（cryo-CLXEM）工作流程，将冷冻软X射线断层成像（cryo-soft X-ray tomography, cryo-SXT）作为中间桥梁技术引入传统cryo-CLEM流程。

研究人员首先通过理论计算验证了工作流程的可行性。关键挑战在于辐射剂量的控制——X射线和电子束都会对样品造成累积损伤。研究团队精确计算了各成像环节的辐射剂量分配，确定cryo-SXT的剂量控制在总剂量预算的10-15%（约数十MGy），从而保证后续cryo-ET仍能达到5纳米或更好的分辨率。

实验流程精心设计：Vero E6细胞接种于电镜载网上，经快速冷冻后，先通过冷冻共聚焦显微镜筛选目标细胞；随后样品运至同步辐射装置进行cryo-SXT成像，在“水窗”能量区（284-543 eV）获取三维结构信息；接着样品返回实验室，基于cryo-SXT提供的精确定位指导cryo-FIB制备薄层样品；最后在冷冻透射电镜中采集cryo-ET数据。

技术方法核心包括：样本制备（Vero E6细胞系、荧光染料标记、快速冷冻）、冷冻共聚焦成像（Leica Stellaris 8系统）、冷冻软X射线断层成像（ALBA同步辐射中心Mistral线站）、冷冻聚焦离子束减薄（Thermo Fisher Aquilos 2系统）以及冷冻电子断层扫描数据采集（300 kV Titan Krios电镜）。

靶向分辨率在降低剂量条件下仍可实现

研究结果显示，即使在控制辐射剂量的条件下，两种模态仍能达到预期分辨率。通过傅里叶壳相关分析，cryo-SXT体积的分辨率约为55-70纳米（半间距分辨率），而cryo-ET体积的分辨率达到约5纳米。

多模态关联成像效果显著，荧光微球、线粒体和多泡体等结构在三种成像模式中均能清晰识别并精确关联。特别值得注意的是，即使样品累积接收高达约200 e/^-/?²（约740 MGy）的辐射剂量，可见膜结构仍未出现明显损伤，证明了剂量控制策略的有效性。

讨论与展望

本研究开发的集成cryo-CLXEM工作流程成功证明了在冷冻共聚焦和cryo-SXT成像后仍能获得高质量冷冻电子断层扫描数据的可行性。尽管目前工作流程的通量仍有提升空间（约15%的cryo-SXT成像样品与制备的FIB薄层有超过50%重叠），但这一多尺度关联成像策略的潜力已经得到充分展现。

研究的重要意义在于打破了X射线与电子成像互斥的传统观念，通过精确的剂量控制实现了三种成像模态的有机结合。cryo-SXT的引入不仅弥补了分辨率间隙，更重要的是保留了被FIB研磨移除的细胞上下文信息，为cryo-ET数据的准确解读提供了不可或缺的参考框架。

随着技术发展，通过使用更易识别的关联标记物和优化关联软件（如3DCT），工作流程的通量和效率有望进一步提高。此外，类似蛋白质晶体学领域的剂量预算计算工具的开发，将有助于更精确地规划多模态成像实验。

该技术特别适用于研究罕见细胞事件和复杂生物系统，如药物作用机制、病原体-宿主相互作用、细胞器重组等研究领域。随着科学研究向更复杂的模型（如组织、类器官）发展，cryo-CLXEM将在连接分子至细胞、细胞至组织尺度的多尺度研究中发挥关键作用，为生命科学研究提供前所未有的洞察力。