瑞马唑仑麻醉对小鼠昼夜节律影响甚微：一项聚焦生物钟基因表达的研究

《Scientific Reports》：Remimazolam-induced anesthesia does not affect circadian rhythms significantly in mice

本刊推荐：为探究静脉麻醉药对生物钟的干扰问题，研究人员开展了瑞马唑仑(RMZ)对小鼠昼夜节律影响的主题研究。结果表明，与吸入麻醉药不同，RMZ麻醉未引起行为节律相位偏移，虽抑制SCN中Per2、Bmal1等核心时钟基因表达，但未改变SCN组织本身的节律周期。这为RMZ不增加术后谵妄风险提供了机制解释，对优化围术期管理具有重要意义。

　　

在医学领域，全身麻醉如同一位技艺高超的“时间魔法师”，能让患者在手术期间暂时失去知觉。然而，这位“魔法师”有时也会不经意地拨乱患者体内的“生物钟”——即昼夜节律。昼夜节律是生命体以大约24小时为周期的一种内在生理节律，由大脑中的“主时钟”视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)负责调控。SCN通过一系列时钟基因（如Per2, Bmal1, Clock等）构成的转录-翻译负反馈环来维持节律的稳定运行。已有研究表明，常用的吸入性全身麻醉药（如地氟烷）会显著干扰SCN的时钟基因表达，导致行为节律（如睡眠-觉醒周期）出现相位偏移，这可能与术后睡眠紊乱、认知功能障碍甚至谵妄等并发症的发生有关。术后谵妄是一种常见的急性脑功能下降，与患者预后不良密切相关。因此，探寻对昼夜节律影响更小的麻醉方案，成为改善围术期结局的一个重要方向。

苯二氮?类(benzodiazepines, BDZ)药物是一类通过增强γ-氨基丁酸A型(GABA_A)受体功能而起效的镇静催眠药，其家族成员咪达唑仑等已被报道会影响昼夜节律。瑞马唑仑(remimazolam, RMZ)是一种超短效的BDZ新成员，因其起效快、代谢迅速、对血流动力学影响小等优点，在临床麻醉和镇静中的应用日益广泛。尤为引人注目的是，一些临床研究提示RMZ可能与较低的术后谵妄发生率相关。那么，RMZ是否真的如其临床表现一样，对掌管我们“生物钟”的SCN“友好”呢？它是否能够避免对昼夜节律产生显著干扰？为了回答这些问题，由Yasuhito Suzuki和Ryo Imai等人组成的研究团队在小鼠身上进行了一系列严谨的实验，旨在系统评估RMZ诱导的麻醉对小鼠行为节律、SCN时钟基因表达以及SCN组织自身节律的影响。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上。

本研究主要采用了以下几项关键技术方法：利用C57BL/6J雄性小鼠（样本量根据效应值0.4、α=0.05、1-β=0.8进行效能分析确定）建立RMZ单次注射和持续输注麻醉模型，监测麻醉起效、恢复时间及生理参数；通过跑轮活动记录和分析在恒定黑暗条件下的行为节律相位偏移、总活动量及活动分布；采用实时定量聚合酶链反应(q-PCR)技术检测SCN组织中核心时钟基因(Per2, Bmal1, Clock, Cryl, Npas2)和即刻早期基因(c-Fos, Egr1)的mRNA表达水平；利用PER2::LUC基因敲入小鼠的SCN组织体外培养模型，通过生物发光成像技术长期监测不同浓度RMZ（单独或联合GABA_A受体拮抗剂氟马西尼）对SCN自身节律周期的影响。

Loss of the Righting Reflex and Recovery

研究人员首先评估了RMZ麻醉在小鼠身上的有效性。结果显示，单次腹腔注射RMZ后，小鼠发生翻正反射消失(loss of the righting reflex, LORR)的潜伏期约为0.75分钟，且在不同给药时间点（以Zeitgeber time, ZT表示）无显著差异。单次注射后恢复翻正反射(recovery of the righting reflex, RORR)的时间约为11.90分钟。而持续输注RMZ麻醉3小时后，RORR时间显著延长至202.73分钟，并且表现出时间依赖性差异，在ZT4-7时段（主观白昼）麻醉的小鼠恢复时间最长。这表明RMZ能产生稳定可靠的麻醉状态，且持续麻醉的恢复时间受昼夜时相影响。

Body Temperature, Respiratory Rate, and Pulse Rate During Anesthesia

在持续RMZ麻醉期间，小鼠的体温呈逐渐下降趋势，在120分钟时降至最低点（35.3°C）。呼吸频率在麻醉30分钟后显著下降至基线水平的61.9%，之后维持稳定。脉搏率虽有下降趋势，但未达到统计学显著性。动脉血气分析显示，麻醉后出现轻度酸中毒和二氧化碳蓄积，而氧分压、碳酸氢根、碱剩余和乳酸水平无显著变化。这些数据表明RMZ麻醉对小鼠呼吸和体温调节有抑制效应，但整体生理状态尚属稳定。

Phase Shift of Rest-Activity Circadian Rhythm after RMZ Anesthesia

这是本研究的核心发现之一。通过精确分析小鼠在恒定黑暗下的跑轮活动节律，研究人员发现，无论是单次注射还是持续输注RMZ，均未引起行为节律相位发生显著偏移。相位偏移量在对照组、RMZ单次注射组和RMZ持续输注组之间无统计学差异。此外，在一天中的不同 circadian time (CT) 施加麻醉，也未观察到显著的相位响应变化。这表明，在本实验条件下，RMZ麻醉并不像某些其他麻醉药或BDZ药物那样，会“重置”动物的行为生物钟。

Total Locomotor Activity after RMZ Anesthesia

尽管不引起相位偏移，RMZ麻醉仍对活动水平产生了短期影响。麻醉后24小时内，RMZ单次注射组和持续输注组的总跑轮活动量分别下降至麻醉前的48.9-74.7%和18.9-37.9%。持续输注组的活动量在24-48小时后基本恢复，至48-72小时所有组别均恢复至麻醉前水平。这反映了麻醉药物对运动功能的暂时性抑制。

Activity Distribution and Inactivity Bout Structure after RMZ Anesthesia

进一步分析活动分布和静止时段结构发现，在主观休息期(CT0-12)，各组总活动量无差异。但在主观活动期(CT12-24)，RMZ持续输注组的总活动量显著低于对照组。然而，在衡量休息质量的“静止时段占比”（即处于持续不活动状态的动物比例）指标上，各组在任何时段均无显著差异。这说明RMZ虽减少了活动期的总活动量，但未破坏动物基本的休息-活动模式结构。

Expression Change of Clock Genes and Immediate-Early Genes

为了探究行为层面现象背后的分子机制，研究人员检测了SCN中关键基因的表达。令人意外的是，持续RMZ麻醉后，SCN中多个核心时钟基因的mRNA表达水平出现了下调：Per2降至83%，Bmal1降至78%，Cryl降至85%，Npas2降至82%。而Clock基因表达未受影响。这种抑制效应不依赖于麻醉实施的昼夜时相。与此同时，作为神经元活动标志的即刻早期基因Egr1的表达显著上调至170%，而c-Fos表达无显著变化。这表明RMZ在抑制部分时钟基因表达的同时，可能对SCN神经元产生了某种兴奋性效应。

Bioluminescent Circadian Period of SCN

最后，为了区分RMZ对SCN中枢时钟的直接作用与可能通过其他通路（如行为活动改变）的间接作用，研究团队使用了PER2::LUC小鼠的SCN体外培养模型。结果显示，在培养基中加入不同浓度的RMZ（最高达100.0 μg/mL），或者同时加入RMZ和其特异性拮抗剂氟马西尼(flumazenil, FMZ)，均未改变SCN组织自发产生的生物发光节律周期。这强有力地证明，RMZ本身并不直接干扰SCN核心时钟振荡器的内在节律产生能力。

归纳研究结论和讨论

综合以上结果，本研究得出明确结论：在实验所用的小鼠模型中，瑞马唑仑诱导的麻醉不会显著改变行为上的休息-活动昼夜节律相位，也不会影响视交叉上核组织本身的内在节律周期。尽管在分子水平上观测到部分时钟基因（Per2, Bmal1, Cryl, Npas2）表达的抑制和神经元活动标志物Egr1的上调，但这些变化并未转化为整体节律系统的功能性偏移。

讨论部分深入分析了这些发现的潜在意义。首先，与本研究团队先前报道的吸入麻醉药地氟烷能引起时间依赖性节律相位偏移和时钟基因表达剧烈波动相比，RMZ的影响显得非常轻微。这种差异可能源于不同麻醉药作用机制的异质性。其次，虽然某些GABA_A受体激动剂（如肌肉醇）和BDZ（如溴替唑仑）被报道能抑制SCN中Per基因表达并诱导相位前移，但RMZ并未产生类似效应。研究者推测，这可能与RMZ在小鼠体内代谢极快，其可能产生抗焦虑效应并进而增加活动量（非光性授时因子）的窗口期非常短暂有关。本研究中观察到的麻醉后活动量下降而非增加，也支持了这一推测。此外，RMZ对SCN时钟基因的抑制效应缺乏时间依赖性，以及其对SCN体外节律无影响，都提示其作用可能并非直接针对核心时钟机制，或是通过其他间接途径实现。Egr1表达的上调暗示RMZ可能对SCN神经元产生了非典型的兴奋作用，这与GABA在SCN中作用的复杂性（兼具抑制和兴奋效应）相符。

本研究的重要意义在于，它从基础研究角度为瑞马唑仑的临床优势提供了新的科学解释。其“不干扰生物钟”的特性，可能与其临床观察到的低术后谵妄风险存在关联。这为围术期选择对神经功能，特别是对维持正常睡眠-觉醒周期至关重要的昼夜节律系统影响更小的麻醉药物提供了重要依据。当然，作者也指出了研究的局限性，如小鼠与人类（夜行性与昼行性）的差异、RMZ在小鼠体内代谢动力学与人类不同、麻醉持续时间相对较短等。未来的研究需要进一步验证这些发现在人类中的适用性，并深入探索RMZ影响时钟基因表达的具体分子通路。

总之，这项研究揭示了瑞马唑仑作为一种新型静脉麻醉药，在维持内源性昼夜节律稳定方面可能具有的独特优势，为优化麻醉策略、改善患者术后恢复质量带来了新的启示。