渗透压调控活细胞dCas9-SunTag系统DNA标记与转录的新机制

《Nature Communications》：Osmotic pressure regulates DNA labelling and transcription with dCas9-SunTag system in live cells

本研究针对细胞核如何响应胞外渗透压变化这一难题，利用dCas9-SunTag系统探究了特定基因组位点的生物物理响应。研究发现渗透压变化可快速、可逆地调控dCas9-SunTag介导的荧光标记效率和基因转录活性，其机制在于渗透压通过改变核内分子拥挤度影响了荧光蛋白/转录激活域与SunTag的结合-解离平衡。该工作不仅揭示了机械信号调控核内生物学过程的新途径，还将dCas9-SunTag系统发展为探测核内拥挤度的灵敏探针，为理解细胞响应胞外刺激提供了新视角。

　　

在我们身体的每一个细胞中，细胞核如同一个指挥中心，精密地调控着DNA的读取和基因的表达。然而，这个指挥中心并非与世隔绝，它持续不断地感受并响应着细胞外部环境的细微变化。其中，渗透压——这个由溶液浓度差异产生的物理力量，是细胞日常面临的关键环境因素之一。以往的研究告诉我们，渗透压能改变细胞的体积、形态，影响细胞骨架，甚至调控一些细胞功能。但一个核心问题始终悬而未决：当细胞外的渗透压发生改变时，深藏于细胞内部的细胞核，其内部环境会发生怎样的变化？这些变化又如何影响DNA相关的关键过程，比如特定基因位置的标记和基因本身的转录活动？由于在活细胞核内实时、原位地测量特定基因组位点的局部环境性质和反应动力学极具挑战性，这个问题一直难以解答。

近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究为解答这一问题带来了突破。由魏谭林、杨晓凤、蒋超等研究人员组成的团队，巧妙地利用了一种名为dCas9-SunTag的强大工具，首次在活细胞中揭示了下渗透压如何通过调节核内分子拥挤度，来动态调控特定DNA位点的荧光标记效率和基因转录活性。这项研究不仅深化了我们对细胞核作为力学感受器的理解，还为利用物理手段调控基因功能提供了新思路。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几个关键技术方法：首先，他们利用dCas9-SunTag系统进行特定基因组位点（如端粒和MUC4基因）的荧光标记和基因转录激活，这是研究的核心工具。其次，他们通过活细胞激光共聚焦显微镜成像，对细胞核体积、荧光焦点强度、染色质和端粒运动等进行实时动态观测。第三，他们采用了荧光漂白恢复（FRAP）技术来评估荧光蛋白与dCas9-SunTag结合的动力学。第四，利用粒子图像测速（PIV）和单粒子追踪技术来量化染色质和特定DNA位点（如端粒）的运动动力学，以评估核内拥挤度的变化。第五，通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和荧光素酶报告基因实验，在群体水平测量基因表达变化。第六，利用MS2-MCP系统标记新生mRNA，在单分子水平实时观察转录爆发现象。研究所用的细胞系主要为HEK293T细胞及其衍生报告细胞系。

研究结果

渗透压调控dCas9-SunTag系统对靶DNA的荧光标记

研究人员首先利用dCas9-SunTag系统对活细胞中的端粒进行荧光标记。dCas9（失活Cas9）负责靶向特定的DNA序列（如端粒重复序列），而SunTag则作为一个支架，能够招募多个携带scFv抗体片段的荧光蛋白（如scFv-mNeonGreen），从而实现信号放大。当研究人员改变细胞外渗透压（通过添加水制造低渗条件，或添加小分子量聚乙二醇PEG制造高渗条件）时，他们观察到了一个惊人的现象：低渗条件使得细胞核内端粒荧光斑点的数量和荧光强度显著增加；而高渗条件则导致这些斑点变暗甚至消失。这种变化是快速、可逆且可重复的。重要的是，当使用直接融合了荧光蛋白的dCas9（dCas9-FP）进行标记时，渗透压的变化对端粒斑点几乎没有影响。这表明，渗透压主要影响的是荧光蛋白与SunTag支架的结合，而不是dCas9与DNA靶点的结合。研究人员在另一个蛋白编码基因MUC4上也观察到了类似的现象，说明这种调控作用可能具有普适性，不依赖于特定的基因组位点。

渗透压调控荧光蛋白与dCas9-SunTag的结合-解离平衡

为了探究上述现象背后的机制，研究人员进行了荧光漂白恢复（FRAP）实验。他们发现，被光漂白后的dCas9-SunTag标记的端粒斑点，其荧光恢复速度远慢于核内自由扩散的荧光蛋白，表明荧光蛋白与SunTag的结合-解离是一个相对缓慢的动态平衡过程。当施加渗透压冲击时，他们实时观察到，低渗冲击促使现有端粒斑点荧光增强（凝聚），甚至出现新的斑点；而高渗冲击则导致斑点荧光减弱（分散）。基于这些观察，他们建立了一个物理模型来描述这一过程。模型拟合结果表明，低渗条件增加了荧光蛋白与SunTag的表观结合速率，而高渗条件增加了表观解离速率。这从理论上支持了渗透压通过扰动结合-解离平衡来调控荧光标记效率的假设。

渗透压通过改变核内动力学和拥挤度来调控结合-解离平衡

那么，渗透压是如何影响结合-解离平衡的呢？研究人员将目光投向了核内分子拥挤度。他们发现，渗透压变化会引起细胞核体积的改变（低渗膨胀，高渗收缩），这直接反映了核内整体拥挤度的变化。通过分析H2B-mCherry标记的染色质运动（使用PIV技术）和dCas9-SunTag标记的端粒运动（使用单粒子追踪技术），他们发现低渗条件增强了染色质和端粒的运动能力，而高渗条件则限制了它们的运动。这意味着低渗降低了核内（包括局部）的分子拥挤度，而高渗则增加了拥挤度。进一步分析显示，端粒的扩散指数（α，表征运动受限程度，与拥挤度负相关）与其荧光强度呈正相关，且在渗透压变化时，平均扩散指数和总荧光强度同步增减。此外，低渗条件下，端粒局部区域的染色质（H2B-mCherry信号）密度降低，同时端粒荧光强度增加；高渗条件下则相反。这些结果强有力地表明，渗透压通过改变核内（特别是局部）的分子拥挤度，影响了荧光蛋白与SunTag的结合能力。研究人员还通过胰蛋白酶处理使细胞变圆、核膨胀（模拟低渗的拥挤度降低效应），同样观察到了端粒标记效率的提升，进一步支持了拥挤度是关键因素的结论。

渗透压调控dCas9-SunTag系统的靶基因转录

最关键的问题是，这种基于拥挤度的调控是否也适用于基因转录？研究人员将dCas9-SunTag系统用于基因激活。他们用scFv融合的转录激活域（如VPR或VP64）替代荧光蛋白，并将其靶向到内源基因HBG1的启动子区域。RT-qPCR结果显示，低渗条件能增强HBG1的mRNA表达，而高渗条件则抑制其表达。为了观察下游蛋白表达，他们使用了一个CRISPRTag-TRE-荧光素酶报告系统，同样发现低渗促进、高渗抑制荧光素酶的表达。更令人兴奋的是，通过MS2-MCP系统标记新生mRNA，他们能够在单基因位点水平实时观察转录活动。他们发现，在等渗条件下，转录以爆发的模式进行。低渗处理增加了转录爆发的频率，而高渗处理则降低了爆发频率。这直接将渗透压的调控作用与基因转录最基础的动力学过程联系起来。

研究结论与意义

这项研究系统地揭示了细胞外渗透压如何通过调节核内分子拥挤度，来影响dCas9-SunTag系统在活细胞中对特定DNA位点的标记效率和基因转录活性。其核心结论是：低渗压力降低核内拥挤度，促进荧光蛋白或转录激活域与dCas9-SunTag的结合，从而增强DNA标记和基因转录；高渗压力则通过增加拥挤度产生相反的效应。这一过程是快速、可逆和可重复的。

这项研究的科学意义重大。首先，它深化了我们对细胞核作为力学感受器的理解，明确了渗透压这一物理信号可以直接影响核内蛋白结合动力学和基因表达等核心生物学过程。其次，研究揭示了一种不同于以往认识的调控机制：在dCas9-SunTag系统中，降低拥挤度（而非增加）反而促进了蛋白质的“凝聚”（即结合），这可能是由于SunTag肽链在稀疏环境中更容易暴露结合位点，挑战了通常认为的“拥挤促进相分离”的范式，强调了核内环境的复杂性。最后，该工作成功地将dCas9-SunTag系统“变身”为一个灵敏的生物学探针，用于探测特定基因组位点的局部拥挤度变化。这为在活细胞中实时、原位研究各种胞外刺激（不仅是渗透压，未来可能包括其他力学、化学信号）对细胞内部微环境的影响提供了强大的工具。展望未来，这种基于机械刺激（渗透压）的调控方式，相较于化光遗传学控制，提供了一种快速、可逆且非侵入性的替代方案，有望应用于基础研究和潜在的生物技术领域。