环丙烷脂肪酸通过调控膜脂质环境调节大肠杆菌膜蛋白NhaA活性的机制研究

《Communications Biology》：Regulation of membrane protein activity by cyclopropane fatty acids in Escherichia coli lipid environment

本研究针对膜脂质脂肪酸组成如何直接调控膜蛋白活性这一关键科学问题，通过构建大肠杆菌脂肪酸合成基因突变株，结合分子动力学模拟，揭示了环丙烷脂肪酸(CFA)通过减弱NhaA-脂质相互作用、限制其构象变化，从而负调控Na+/H+逆向转运蛋白活性的新机制，为理解细菌环境适应性提供了重要理论依据。

　　

在细菌的世界里，细胞膜不仅是隔离内外的屏障，更是生命活动的重要舞台。膜蛋白作为这座舞台上的主要演员，其功能发挥深受脂质环境的影响。然而，相较于磷脂头基的研究，脂肪酸组成如何精确调控膜蛋白功能仍是未解之谜。特别是在大肠杆菌中，环丙烷脂肪酸(CFA)作为一类特殊修饰的脂肪酸，其在稳定期和应激条件下大量积累，被认为能增强细菌对乙醇、高渗、低pH等多种逆境的耐受性，但具体机制尚不明确。

近日发表于《Communications Biology》的研究首次揭示，CFA能够通过调节膜脂质物理性质直接调控大肠杆菌关键膜蛋白NhaA的活性。这项研究由东京大学农业与生命科学研究科 agro-生物技术研究中心的Kazumasa Hori等人完成，他们通过巧妙的遗传学操作、生物化学分析和分子动力学模拟，多角度验证了CFA对NhaA的抑制作用，为理解细菌如何通过调节膜脂组成来适应环境变化提供了新视角。

研究人员主要运用了基因敲除技术构建脂肪酸合成相关突变株、荧光淬灭法测定Na⁺/H⁺逆向转运活性、蛋白质免疫印迹分析膜蛋白表达量、薄层色谱分析磷脂组成，以及全原子分子动力学模拟研究蛋白质-脂质相互作用。

脂肪酸组成突变株的构建与分析

为了探究脂肪酸组成与Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性的关系，研究团队构建了cfa和fabR基因的单敲除和双敲除突变株。cfa编码环丙烷脂肪酸合酶，负责将不饱和脂肪酸(UFA)转化为CFA；fabR则编码UFA合成的转录抑制因子。通过气相色谱分析证实，Δcfa菌株完全缺失CFA，ΔfabR菌株的UFA和CFA比例从50%升至70%，而ΔcfaΔfabR双突变株则兼具两者的特征。

Na⁺/H⁺逆向转运活性测定

研究人员利用膜翻转囊泡和pH敏感性荧光染料吖啶橙，检测了各突变株的Na⁺/H⁺逆向转运活性。结果显示，Δcfa和ΔcfaΔfabR菌株的活性比野生型(WT)提高约1.4倍，而ΔfabR菌株的活性降至WT的0.5倍。相关性分析发现，CFA/SFA(饱和脂肪酸)比值与NhaA活性呈强负相关(r = -0.98)，表明CFA相对SFA的比例越高，NhaA活性越低。

NhaA特异性活性验证

为了确认观察到的活性变化确实源于NhaA，研究者在nhaA nhaB chaA三敲除背景(Δ3)下回补nhaA基因。Δ3Δcfa/nhaA菌株的活性比Δ3/nhaA提高2.2倍，而Δ3ΔfabR/nhaA则降至0.7倍，与WT背景下的趋势一致。蛋白质免疫印迹证实，膜嵌入的NhaA蛋白量在各菌株间无显著差异，排除表达量影响。

磷脂头基组成分析

薄层色谱分析显示，各突变株的磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和心磷脂(CL)比例与WT相比仅有微小变化，且这些变化不足以解释观察到的活性差异，进一步支持脂肪酸组成是主要影响因素。

分子动力学模拟揭示分子机制

分子动力学模拟比较了NhaA在WT和Δcfa模型膜中的行为。Δcfa膜(缺乏环丙烷环)与NhaA的相互作用能(-3820±60 kJ/mol)显著高于WT膜(-3620±120 kJ/mol)，表明更紧密的膜包装增强了蛋白质-脂质相互作用。跨膜螺旋5(TM5)的胞质侧和膜间隙侧环区氨基酸与膜脂的相互作用在Δcfa膜中增强，可能促进了TM5的弯曲(Δcfa: 15.1°±2.2 vs WT: 10.3°±2.4)。此外，Δcfa膜的脂质有序参数更高，平均脂质面积更小(57.0±0.1 ?² vs WT 58.0±0.2 ?²)，表明膜包装更紧密。细胞质门区域的回转半径在Δcfa膜中也略大(4.7±0.2 nm vs 4.2±0.2 nm)，提示更开放的构象。

生理功能验证

在0.7 M NaCl胁迫下，Δ3Δcfa/nhaA菌株的生长优于Δ3/nhaA，而Δ3ΔfabR/nhaA生长较差。回补cfa基因后，Δ3Δcfa/nhaA/cfa的生长受到抑制，与Δ3/nhaA/cfa相当，证实CFA通过调节NhaA活性影响细菌的耐盐性。

本研究首次证实CFA通过改变膜脂质包装状态调控NhaA活性。CFA的引入增加脂质平均面积， loosening膜包装，减弱膜与NhaA的相互作用，可能限制TM5构象变化，进而抑制转运活性。相反，Δcfa菌株膜包装更紧密，增强蛋白质-脂质相互作用，促进TM5弯曲和细胞质门开放，提高Na⁺外排效率。这一机制将脂肪酸代谢与膜蛋白功能直接关联，解释了CFA在细菌应激响应中的生理意义：通过动态调节CFA合成，细菌可能精细调控NhaA等关键膜蛋白的活性，以适应环境变化。该研究不仅深化了对脂质-蛋白质相互作用的理解，也为针对细菌膜环境的抗菌策略开发提供了新思路。