《Regional Studies in Marine Science》：Comparison of environmental DNA metabarcoding and morphological classification for assessing benthic diversity in the salt marsh of Dingzi Bay, China
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盐沼生态系统benthos群落通过eDNA metabarcoding与传统形态学分类对比研究，验证了COI和18S基因组合及TAReuk454FWD1/TAReukREV3引物的有效性，发现eDNA可检测更多微生境物种但存在部分序列数据库缺失问题，两者结合能更全面评估生物多样性。
作者：纪英璐、尚杰、蒲思超、张亮、苏凯、刘玉萌、孙硕、王志
中国自然资源部北海预报与减灾中心，青岛市266061
摘要
保护海洋生态系统免受人类活动日益增加的影响面临诸多挑战，这主要是由于传统分类系统的局限性。开发可靠且实用的方法来识别和量化生活在这些生态系统中的潜在隐秘物种，对于全面了解海洋动物的多样性和空间分布至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术的快速发展为海洋生物多样性监测提供了新的实用途径。然而，目前很少有研究对不同海洋生态系统中的底栖生物群落进行全面的比较分析。通过将eDNA宏条形码技术与传统的形态分类方法进行对比，我们评估了四组引物和两种遗传标记（COI和18S）在盐沼生境中检测海洋底栖生物的有效性。研究结果表明，这两种标记识别的物种之间存在很强的互补性，且某些物种在NCBI数据库中没有代表性序列。根据α多样性和β多样性分析，TAReuk454FWD1/TAReukREV3引物的结果与形态分类的结果高度一致。将传统的生态调查方法与eDNA技术相结合，可以为区域生物多样性的评估提供更完善的框架。为了提高基于eDNA的研究中的分类效率，精心选择多种标记基因至关重要。
引言
底栖生物调查是中国海洋生态监测系统的基础组成部分，也被广泛用于评估全球水生栖息地的生态健康状况（Rosenberg等人，2004年；Brey，2012年；Borja等人，2015年）。过去，形态分类一直是常规底栖生物评估中用于物种识别的主要方法。由于中国海洋底栖生物的丰富多样性，传统的形态分类方法不仅耗时较长，而且需要丰富的分类学知识，因此存在诸多困难。此外，隐秘物种的存在使得识别更加困难，遗传变异性的限制以及某些发育阶段的影响也可能导致分类错误（Jarman和Elliott，2000年；Smith等人，2006年）。
为了揭示物种多样性，人们利用环境矩阵提取eDNA，即生物体释放到环境中的遗传物质（Valiere和Taberlet，2000年；Bunce等人，2005年）。eDNA宏条形码技术使用通用引物通过聚合酶链反应（PCR）扩增环境中的DNA。高通量测序结合这项技术可以产生大量代表物种多样性的序列。后续的序列分析有助于确定物种组成、群落结构和其他环境生物多样性指标（Chen等人，2016年）。通过序列分析可以揭示环境中的群落组成和结构。与传统形态监测方法相比，eDNA宏条形码技术能够更有效地检测到许多被遗漏的物种。此外，它还能在物种或属水平上准确识别大多数分类单元，从而快速、准确地评估生态系统内生物群落的微小变化（Aylagas等人，2016年；Gibson等人，2014年）。
生物多样性的估计结果取决于所使用的分子标记，整合多种标记可以改善分类效果。在底栖生物种群评估中，通常使用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因的部分序列（Yao，2018年），而核小亚基18S rRNA（18S）基因也常用于海洋生境的研究（Lejzerowicz等人，2015年）。此外，引物对目标序列的亲和力可能会影响宏条形码的结果，因此引物选择对宏条形码研究中的分类效果有显著影响（Duarte等人，2021年）。尽管已知引物选择对分类单元的识别有影响（Hollatz等人，2017年），但很少有研究在不同生态系统的生物群落中进行系统的比较，尤其是那些具有高度系统发育多样性的海洋和河口群落。
鉴于此，本研究采用了一种双重监测方法，结合了传统的形态分类技术和eDNA宏条形码技术。该研究使用多组引物分析了盐沼生境中底栖生物的物种组成，评估了多种方法在识别海洋底栖物种方面的适用性，从而更全面地了解了丁子湾盐沼的生物多样性状况。
样本采集
本研究在丁子湾进行，该湾位于山东半岛南部，是一个半封闭的沿海海湾，受到多条河流的影响，并且只有一个潮汐入口。湾内的潮汐流主要呈往返流动模式，方向是从西北向东南，具有规律的半日潮汐制度（Tang等人，2019年）。盐沼的形成是由于细粒沉积物的流入所致。
形态分类
图2显示了通过四种eDNA引物和形态分类方法确定的底栖生物群落组成，其中形态分类主要监测大型底栖生物。在丁子湾盐沼中发现了49种大型底栖生物，属于5个门（环节动物门、软体动物门、节肢动物门、腕足动物门和脊索动物门）的43个属。其中，软体动物占42.9%。丁子湾盐沼中主要的大型底栖生物是Ceratia nagashima（IRI=1.783）。
形态分类与eDNA宏条形码技术的比较
本研究通过形态分类技术和eDNA宏条形码技术评估了丁子湾盐沼的海洋底栖生物多样性。根据研究结果，两种方法得出的底栖生物群落组成存在显著差异。与形态分类相比，eDNA宏条形码技术检测到了更多的分类单元，并且更容易识别多种小型底栖生物，从而进一步扩展了底栖生物多样性的研究范围。
未引用的参考文献
Halpern等人，（2008年）
资助
本研究得到了自然资源部海洋生态监测与修复技术重点实验室（MEMRT202306）、山东省海洋生态与环境及灾害防治重点实验室（202311）以及自然资源部渤海生态预警、保护与修复重点实验室（2023110）的支持。
CRediT作者贡献声明
尚杰：项目管理和资金申请。纪英璐：初稿撰写和正式数据分析。王志：撰写和审稿编辑。孙硕：初稿撰写。刘玉萌：初稿撰写。苏凯：调查和正式数据分析。张亮：调查和正式数据分析。蒲思超：调查和正式数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢中国科学院烟台海岸带研究所的傅庆璐、陈琳琳和李宝全在研究过程中给予的巨大支持，以及所有参与采样和初步实验室工作的人员。同时感谢Novogene Biotech有限公司提供的测序服务。
