森林砍伐下夜行蜂的低恢复力与其广食性及对先锋植物的依赖形成鲜明对比

《Apidologie》：Low resilience to deforestation in nocturnal bees is counteracted by a broad resource range and reliance on pioneers

本研究针对热带夜行蜂Megalopta在森林再生过程中的恢复动态及其资源利用策略展开研究。通过在厄瓜多尔西北部建立森林演替时间序列，并结合新一代测序技术分析花粉负载，研究人员发现Megalopta蜂对干扰表现出低抵抗力且恢复缓慢，其丰度在38年演替后仍未恢复到原始林水平。然而，其食性广泛，涵盖120多种植物，且主要依赖先锋树种。这种广泛的资源利用范围有助于维持传粉网络在演替过程中的稳定性，但该蜂类对原始林冠层的依赖表明其仍易受大面积原生栖息地丧失的影响。

　　

在热带生态系统中，昆虫多样性的全球性崩溃正威胁着诸多关键的生态过程，从土壤功能的维持到大多数被子植物的传粉服务。其中，作为全球主要传粉者的蜜蜂种群衰退，尤其会破坏传粉网络，并对植物生命周期、生态系统动态和森林恢复产生不利影响。然而，目前关于干扰如何影响昆虫传粉者及其与植物的相互作用网络，尤其是对夜行性类群（如蛾类和夜行蜂）的影响，仍存在显著的知识空白。

夜行蜂主要包括集蜂科（Colletidae）、隧蜂科（Halictidae）和蜜蜂科（Apidae）中的少数几个属，它们被认为是通过进化出夜行和晨昏活动习性来逃避与日行昆虫的竞争。这类蜂能够利用夜间开花（如蝙蝠和蛾类传粉的植物）以及日行植物中较晚开花的花朵，因此可能有助于增强网络连通性和生态系统稳定性。Megalopta Smith, 1853（隧蜂科）是新热带区占主导地位的夜行蜂类群，包含35种已知物种，属于Augochlorini族，是体型较大、兼性社会性的蜜蜂，具有适应晨昏和夜间生活的特征，主要是增大的单眼以辅助光感知。尽管其在昼夜节律、温度调节和视觉敏锐度等方面的适应性引起了研究者的兴趣，但由于其夜行习性，该类群很少被纳入传粉者多样性评估中。因此，它们的生态学、栖息地需求、对干扰的响应以及植物资源专化性等都知之甚少。

此前，仅有Smith等人（2012）通过显微镜对巴拿马巴罗科罗拉多岛上的Megalopta蜜蜂的花粉利用进行了较为全面的评估，发现花粉负载多样，但大部分花粉来自少数几种大型的蝙蝠传粉树木，表明其对特定植物物种具有相对较高的忠诚度。这种依赖于少数林冠层蝙蝠传粉植物的食性，如果大面积原始林被移除或破碎化，可能会威胁到这些蜜蜂的生存和资源供给。鉴于该类群在新热带区的假定生态重要性（包括对作物物种的传粉），当前关于其饮食需求、资源专化性和传粉网络脆弱性的知识仍然匮乏。此外，关于其种群对栖息地干扰或沿恢复梯度的趋势信息更是空白。

为此，研究人员在厄瓜多尔西部的乔科-达连生物多样性热点地区一个解析度较高的演替时间序列中，评估了夜行蜂的恢复情况，并通过花粉代谢条形码技术研究了它们的食性宽度和相互作用网络。研究人员提出了两个主要假设：（i）由于在无林冠或早期林冠形成的样地（活跃和早期演替样地）中存在更严酷的非生物条件，以及缺乏与原始林相关的特定资源，Megalopta蜜蜂将表现出对干扰的低抵抗力和低恢复力（恢复缓慢）。（ii）尽管通过高通量花粉测序会发现Megalopta的花粉负载包含广泛的植物属，但其相互作用网络应是特化的，并由原始林中发现的少数蝙蝠或蛾类传粉的树木主导，而活跃和早期演替的森林将表现出规模小得多且泛化的网络，很可能包含从森林内部觅食个体的外源相互作用。

为了验证这些假设，研究团队在厄瓜多尔西北部的Rio Canandé和Tesoro Escondido保护区进行了研究。该地区是典型的低地热带雨林，由大片原始林和人类定居点、村庄组成的镶嵌体，土地利用频繁且集约，主要用于养牛和种植作物，特别是可可单一种植园。研究在62个50米×50米的样方中进行，这些样方属于一个演替时间序列，包括12个活跃干扰样地（6个可可种植园和6个牧场）、17个再生样地（先前为可可种植园，再生年限1-37年）、16个再生样地（先前为牧场，再生年限1-35年）以及17个未受干扰的原始林样地。研究在2022年3月至5月和10月至12月进行了两次采集活动。在每个样地中使用配备Lepi-LED迷你灯的白色翼状陷阱来收集Megalopta蜜蜂，灯设置在混合光（可见光和紫外光）模式，使用氯仿烟雾作为快速致死剂。陷阱设置在离地约1.5米高处，运作时间为傍晚18:00至次日早晨06:00。此外，由于Megalopta蜜蜂可能与林冠层相关联，在所有具有显著林冠覆盖且至少有一棵树高15米或以上的样地（N=26）中，还使用滑轮系统在林冠层（离地15-37米）设置了陷阱。采集后，蜜蜂通过专业文献进行形态鉴定，并对每个标本在体视显微镜下检查腿部花粉刷或腹部是否有花粉。当存在花粉时，收集一条腿或刮取腹部花粉刷上的花粉，将同一物种的个体样本按样地混合，于-20°C保存并送往进行分子分析。同时，为辅助物种区分，对每个形态型（3-4个个体）采集了条形码样本（COI-5P区域），送至加拿大DNA条形码中心进行扩增和测序， resulting sequences存储在BOLD系统中。标本还通过与参考收藏（主要由Leandro Santos在其巴西Megalopta分类学修订期间鉴定）进行直接比较后再次确认。

花粉样本进行了ITS2区域的多重下一代测序DNA代谢条形码分析。DNA提取、质量控制、文库制备和测序在德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学完成。生物信息学分析使用了特定的分析流程，该流程使用VSEARCH进行质量过滤、合并、去重复和通过去噪定义扩增子序列变异（ASV）。分类学分配采用迭代方法，首先以97%的相似度阈值与本地化数据库进行全局比对。剩余的未分类ASV与全球维管植物数据库进行比较，并使用VSEARCH全局比对（阈值97%）。最后，使用SINTAX（阈值0.8）对剩余未分类的读段进行分层分类，直至最低可能的分类水平。使用R语言的phyloseq包评估阴性对照样本，并移除可疑的欧洲类群ASV。将ASV在物种水平进行聚合，并转换为相对读长丰度。根据阳性对照样本的结果，将低于样本贡献度1%的低丰度类群从相应样本中移除。过滤后，数据用于构建aij邻接相互作用矩阵，其中交互aij对应于含有植物物种j花粉的蜂种i的样本数量。

随后，每个至少鉴定到属级的植物分类单元根据其（i）生活型（草本、灌木或藤本；先锋树；林下小树或树苗；原始林亚林冠层和 emergent trees；附生植物或藤本植物）、（ii）为传粉者提供的主要花部资源（花蜜、花粉、树脂、油或其他）以及（iii）花朵显示的传粉系统（日行蜂、夜行蜂、蛾类、蝙蝠、鸟类、日行泛化传粉者、小型多样昆虫（SDI）或风媒/兼性风媒）进行分类。

在统计分析方面，为了评估Megalopta群落的恢复，研究人员测量了每个样地的四个参数：（i）丰度；（ii）多样性（以稀化指数香农熵衡量）；（iii）携带花粉的蜜蜂比例；以及（iv）通过代谢条形码确定的相互作用总数。他们使用广义线性混合模型（GLMM）来分别分析这些参数对恢复年限和干扰历史（牧场或可可种植园）的响应，并将采集样地设置为随机效应变量。对于包含原始林在内的全局模型，则使用样地年龄类别（活跃干扰、早期再生（1-14年）、晚期再生（15-38年）和原始林）作为演替梯度的代理变量，并纳入环境变量（海拔、森林连通性、植物多样性和分层）作为预测变量。通过多模型推断进行成对模型选择，使用△AICc≥2.0作为排除标准，并对 plausible 模型的系数根据模型权重进行平均。

为了识别Megalopta消耗的关键资源类型，研究人员估算了每个植物分类单元在花粉传递网络中的中心性，通过其加权接近中心性来衡量。然后通过Kruskal-Wallis检验和事后Dunn检验，比较了不同植物生长习性类别、花部资源类型和传粉系统之间的中心性差异。此外，评估了沿演替梯度的网络结构，将相互作用按年龄类别合并后，计算了相互作用香农多样性（H'）、连接密度（LD）以及与原始林相互作用的平均相似性（sOG）。

研究结果揭示，共捕获493只蜜蜂（473只雌蜂，20只雄蜂），分属4个物种：Megalopta sodalis（334只，占67.7%）、一个形态相似但遗传 distinct 且体型更大的物种（暂称Megalopta sp.）（68只，13.8%）、Megalopta amoena（90只，18.4%）以及一只属于夜行性 genus Megaloptina sp.的雄蜂。来自19个样地的35只雌蜂身体上携带花粉，最终成功对27个混合花粉样本进行了测序。

蜜蜂在活跃干扰样地上很罕见，但其丰度和多样性沿着演替时间序列增加，且不同干扰历史之间无显著差异。然而，蜜蜂在原始林中，特别是在林冠层，丰度显著更高。其丰度表现出低抵抗力，在时间序列结束时（38年）仅恢复到原始林冠层中位数的41.6%，这相当于原始林冠层观测中位数的8.3%。多样性同样表现出低抵抗力（原始林冠层中位数的31.4%），但恢复速度相当快，在晚期演替森林中达到了观测到的原始林冠层中位数。相反，携带花粉的蜜蜂比例在早期再生样地较高，并沿演替时间序列下降，但在原始林冠层中再次上升。相互作用的数量在整个演替时间序列中没有变化。

最 plausible 的模型表明，Megalopta的丰度受到森林分层的显著影响，蜜蜂在林冠层的丰度 considerably higher（β=1.75, adjusted SE=0.35, p<0.001）。分层与年龄的交互作用也显著，仅在晚期再生阶段林下层栖息着更多的蜜蜂（β=1.70, adjusted SE=0.56, p<0.005）。对于多样性，只有一个包含森林分层的模型是 plausible 的，蜜蜂在林冠层也更多样（β=0.47, aSE=0.18, Z=2.65, p<0.01）。相反，只有森林连通性显著负向影响携带花粉的蜜蜂比例（β=-0.04, aSE=0.01, p=0.02）和相互作用数量（β=-0.41, aSE=0.15, p=0.007），在森林覆盖更多的样地周围，记录到的花粉携带者比例和相互作用更少。此外，在整个演替序列中，林下层的相互作用也较少（β=-0.66, aSE=0.30, p=0.03）。

过滤后，共观察到249个相互作用，涉及124个植物物种，分属72个属和38个科。花粉负载以先锋树Clusia multiflora和Cecropia insignis为主。总体而言，花蜜是主要提供的资源类型，SDI和日行蜂传粉植物是最常见的传粉系统。就物种数量而言，植物生活型大致均匀分布，而花蜜和花粉是主要的资源类型。小型多样昆虫、日行蜂和蛾类传粉系统约占所涉及相互作用植物的75%。

在网络重要性方面，先锋树表现出最高的中心性，与除原始林冠层树外的所有其他植物习性类型均有显著差异（x2=10.41, df=4, p=0.03）。中心性在资源类型间无显著差异（x2=4.38, df=3, p=0.23），尽管事后成对比较表明，提供树脂的植物重要性显著高于提供花粉的植物。中心性在传粉系统间也无差异（x2=4.40, df=6, p=0.62）。

网络结构沿演替梯度发生显著变化。在活跃干扰样地中很少观察到相互作用，其中缺乏重要物种（如Clusia, Guarea）和植物提供的一些稀有资源类型（树脂）。相互作用多样性、连接密度以及植物习性、资源类型和传粉系统的范围在早期演替样地中较高，与原始林相当。晚期演替森林的相互作用非常少，网络结构与活跃干扰样地相似。

就相互作用组成而言，不同演替阶段高度重叠，包括作为参照的原始林。此外，原始林样地间变异很大，表现为各样地与原始林质心的相似性中等（sOG=0.62±0.15）。尽管如此，活跃干扰样地与原始林的相似性最低，早期和晚期演替样地依次递增，后者尽管网络规模小，但与原始林具有可比性。

本研究阐明了Megalopta蜜蜂的栖息地利用和对干扰的脆弱性，以及它们的恢复趋势和对开花植物的访问模式。蜜蜂在丰度和多样性上表现出强烈的分层现象和与原始林冠层的关联，对活跃干扰表现出低抵抗力。虽然多样性在时间序列呈现的四十年内恢复到了参照水平，但丰度并未完全恢复。然而，多样性总体上较低，每个样地最多只有三个物种，这由于样地间变异空间小，阻碍了对这一趋势的具体解释。与丰度和多样性相反，花粉携带在活跃样地或早期再生森林中更为频繁。这种出现频率和访花模式的相反趋势，加上花粉负载中先锋植物的突出地位，表明原始林中Megalopta的高丰度并非主要由资源可用性驱动，并且它们经常在附近的开放区域觅食。

因此，蜜蜂对原始林冠层的明显依赖可能仅部分与热带林冠层花卉资源的集中有关，而在更大程度上可能与巢穴基质的可用性相关。事实上，Megalopta蜜蜂在枯死的树枝和藤本植物中挖掘巢穴，这些巢穴通常悬垂于地面之上。Janzen（1968）曾提出Megalopta更倾向于在林冠层觅食和筑巢。林冠层富含天然空腔，并且经常有洞巢昆虫栖息。此外，尽管夜行蜂比具有标准联立式复眼的日行昆虫对光敏感得多，但它们并不像许多蛾类那样拥有重叠式复眼。因此，它们的觅食和一般定向都受光强度调节，这在黑暗的林下层可能受到阻碍，导致蜜蜂寻求林冠层或开阔斑块用于筑巢和觅食。另外，Megalopta是兼性社会性的，每个蜂巢最多可有十只雌蜂，这可能会增加蜂巢附近蜜蜂的密度，从而提高捕获率。然而，巢址可用性与蜜蜂在林冠层出现率较高之间的关联在本研究中并未直接评估，仍需正式验证。

森林占用也可能受非生物胁迫驱动。夜行蜂对高温和低湿度敏感，这可能会限制它们在开放环境中的觅食（从原始林样本中先锋植物和喜光物种的高比例可见），使其仅限于短时间的外出。前往森林外觅食区的通勤可能得益于它们的中等到大型体型以及随之而来的更广觅食范围，这与许多真社会性小型蜂群形成对比。在森林连通性对花粉携带比例的负影响中进一步支持了这种觅食行为，因为觅食活动会因森林周围基质（matrix）的比例和接近程度而得到促进。这种蜜蜂在古老森林林冠层的高出现率与明显利用基质进行觅食的二分法，也可能解释了在晚期再生样地中蜜蜂和相互作用的低丰度，这些样地的林冠闭合处于初始阶段，但喜光的先锋植物（如Cecropia）已经被淘汰。

Megalopta蜜蜂对原始且分层的低地雨林的明显依赖表明，大面积原始林冠覆盖的丧失（这会显著增加非生物条件的严酷性，并可能导致巢穴资源减少）很可能会减少当地的Megalopta种群。这种依赖性可能也适用于其他夜间或晨昏活动的蜂类（如Ptiloglossa, Xylocopa, Megommation）、其他与森林相关的夜行昆虫（如蛾类和甲虫），甚至同样表现出对林冠层强烈依赖的社会性日行蜂。尽管对森林丧失敏感，但Megalopta表现出广泛的资源利用，其花粉负载中包含大量低丰度植物，这符合研究人员的预期，并证实了该类群的泛化性。在发生慢性或中度栖息地丧失的情况下，Megalopta蜜蜂可能仍然能够通过食性可塑性来维持种群。甚至风媒/兼性风媒的草种（如Paspalum, Poaceae）也被记录在花粉负载中，表明蜜蜂并不挑剔，甚至可以在开放的草原生境中觅食。这种可塑性在其他夜行蜂中也有报道，包括Ptiloglossa（集蜂科）和Xylocopa（蜜蜂科）的物种。泛化性通常也见于日行的Augochlorini蜂以及整个隧蜂科，这表明多食性可能是该科的一个共享的基部特征。在日行蜂中，多食性也常见于真社会性物种，包括蜜蜂和大多数热带无刺蜂，作为供应其大型蜂群的一种手段。类似地，Megalopta的多食性因此可能对其幼虫的批量供应至关重要。Somanathan等人（2020）进一步提出，蜜蜂向夜行性的进化带来了额外的适应成本，因此伴随着花粉泛化性、低的花卉忠诚度以及对日行花卉残留物的高度依赖。夜行蜂和日行蜂因此可能呈现高度重叠的食性。

确实，与先前关于访问大花和夜间开花树木的观察不同，这些树木在研究地点主要由开花期间的Inga（豆科）、Ochroma和Quararibea（锦葵科）代表，但在本研究的花粉负载中并不占主导地位。此外，在该地常见的先锋蝙蝠传粉物种在网络中处于边缘地位，进一步表明对Clusia multiflora和Cecropia insignis的依赖并非偶然，并且可能以牺牲富含花蜜的蝙蝠传粉花朵或原始林物种为代价。虽然Clusia主要提供树脂，但少量证据表明C. multiflora可能产生花蜜并被蜂鸟访问，这解释了Megalopta的频繁访问，它们会在该物种上觅食花蜜和花粉。没有证据表明Megalopta会收集树脂，虽然树脂在蜂巢中潜在的药理或卫生用途不应被排除，但对C. multiflora及该属其他物种的访问很可能不是以树脂为目标。同样的情况可能适用于在花粉负载中发现的提供油脂的Malpighiaceae。Smith等人（2012）也报道了单个蜜蜂仅使用少数几种植物物种进行花粉供应，这表明Megalopta不会像其他独居的多食性蜜蜂那样在供应物中混合花粉。因此，植物选择可能主要受花粉密度和暴露程度以及景观内植物可用性的驱动，或受特定的挥发性气味混合物或花粉的物种特异性营养特性的驱动。然而，与先前花粉利用评估的差异指出，资源偏好可能进一步取决于所考虑的生态系统、生物群落和植物群落。

除了夜间开花植物的花粉携带率出乎意料地低之外，专门由夜行蜂传粉的网络中唯一确认的属——Paullinia clathrata（无患子科）在花粉库中并不占主导地位。这种相互作用表明特化传粉系统与泛化传粉者之间存在不对称性，这在传粉网络中很常见。另一个 curious 的结果是观察到了与Souroubea guianensis（Marcgravia科）的相互作用，该物种的花部特征与任何特定综合征无关，其传粉者尚不清楚（但夜行蜂可能发挥作用）。该物种是出现在林冠层的藤本植物，因此直接观察访花者很困难。其花粉出现在Megalopta身上以及蜜蜂与森林林冠层的关联可能暗示了一种夜行蜂传粉系统。这些发现凸显了在群落背景下定位相互作用和传粉者食性时，以动物为中心的花粉分析的优势，特别是在借助可能检测到稀有相互作用的高通量分子分析时。

然而，本研究存在一些局限性。光诱捕收集无法提供关于蜜蜂个体来源的信息。因此，从个体采样的相互作用可能经常是采集样地外源的，这是被动以动物为中心的相互作用采样固有的局限性。对于像Megalopta这样流动性强的生物尤其如此。因此，虽然我们的网络数据可以提供关于蜜蜂在样地及周边区域的栖息地利用和食性的信息，但它不应被严格视为样地尺度的相互作用数据库，特别是因为本研究中的一些样地尽管平均距离约5公里，但最小距离小于一公里。不过，Brehm（2017）认为，本研究使用的特定灯管与其他低功率灯类似，吸引半径小，因此能提供局域化的群落估计，这可能通过阻止样地外蜜蜂的吸引而减轻了样地距离的影响。此外，尽管付出了巨大的收集努力，我们的样本量不如其他评估大，这也可能与使用光诱捕器而非蜂巢采样有关。因此，花粉样本在不同样地类型间的分布不平衡，大部分来自再生区域。再生区域在花粉数据中的这种 overrepresentation，虽然可能是该区域蜜蜂觅食活动增加的结果，但可能导致高估了蜜蜂对丰富先锋植物（如Clusia和Cecropia）的偏好。这也进一步强调，应从样地年龄对网络模式影响中得出的启示需谨慎对待。未来在类似的恢复时间序列或再生梯度设置中，旨在探索夜行蜂的食性及其恢复力的研究，将受益于蜂巢和诱捕器采样的互补使用，并结合源植物的可用性评估。

尽管如此，我们的结果强调了以动物为中心的分子方法在评估传粉者资源利用方面的强大能力，特别是因为分层可能导致在森林生态系统中检测它们的困难，以及由于在夜间直接评估相互作用（尤其是在林冠层）存在 logistical 限制。这些方法可以显著增加我们对传粉者资源需求的了解，并为我们提供关于它们觅食策略和景观利用的信息。确实，观察到的Megalopta的取食泛化性以及对不同习性和传粉系统植物的消耗，可能作为应对原始林丧失的生命线，并表明这些蜜蜂利用了高度动态的热带森林。然而，Megalopta蜜蜂在四十年后仍未完全恢复，表明它们易受大规模原始林丧失或针对古老硬木林冠树种的有针对性砍伐的影响，这会显著降低森林的结构复杂性。这些不利影响可能也适用于其他经历非生物胁迫的夜行性属，以及众多林冠特化或洞巢动物，从而凸显了保护原始雨林栖息地的迫切需求。我们的结果也 warrant 对垂直分层的驱动因素、非森林生态系统中觅食模式的差异以及Megalopta蜜蜂与提供树脂和日行泛化传粉花朵之间的相互依赖关系进行更详细的检验。