基于自组装纳米颗粒与靶标触发信号扩增的比率型近红外生物传感器用于miRNA的高灵敏检测

《RSC Advances》：Ratiometric near-infrared biosensors based on self-assembled nanoparticles and target-triggered signal amplification for sensitive detection of miRNAs

microRNA-21（miRNA-21）的异常表达与急性心肌梗死高度相关，可作为其早期诊断的生物标志物。在本研究中，研究人员构建了一种基于靶标触发信号扩增的比率型荧光探针，采用上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）作为能量供体、金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）作为能量受体，用于检测miRNA-21。首先，末端同时带有巯基和氨基的发夹DNA（H1）分别通过Au–S键和酰胺键连接至AuNPs与UCNPs，从而导致上转换发光（upconversion luminescence，UCL）被猝灭。靶标miRNA-21可触发H1并形成miRNA/H1双链结构，使AuNPs远离UCNPs，从而恢复UCL。打开的H1发夹进一步暴露出可识别另一条带有Cy5标记的发夹DNA（H2）的片段，进而使靶标miRNA-21被H2置换并触发催化发夹组装（catalytic hairpin assembly，CHA）信号放大。Cy5的稳定荧光与UCNPs变化的UCL共同构建出比率型生物传感器，用于检测miRNA-21，其检出限（limit of detection，LOD）低至0.28 pM。此外，该生物传感器还可用于血清样本中miRNA-21的测定，回收率为94.3–102.7%，表明所提出的方法在临床样本生物标志物的高灵敏、准确检测中具有广阔应用前景。

该论文发表于《RSC Advances》，围绕急性心肌梗死相关生物标志物microRNA-21（miRNA-21）的高灵敏检测展开研究。miRNAs是一类长度约18–24个核苷酸的单链非编码RNA，在转录后基因调控中发挥关键作用，而miRNA-21异常表达与急性心肌梗死密切相关，因此其精准定量对于疾病早期诊断具有重要意义。然而，miRNA-21在生理样本中丰度较低，且与其他miRNA存在较高序列相似性，导致其检测在灵敏度与选择性方面均面临明显挑战。现有反转录-定量聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、northern blot和微阵列等方法虽被广泛应用，但普遍存在分析时间长、仪器依赖强、易受环境干扰以及灵敏度有限等问题。因此，开发兼具高扩增效率、低背景干扰和优异特异性的检测策略，成为miRNA-21分析的重要研究方向。

在此背景下，研究人员构建了一种基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的比率型近红外生物传感平台，将上转换纳米颗粒（UCNPs）、金纳米颗粒（AuNPs）与催化发夹组装（CHA）信号扩增策略相结合，用于miRNA-21的灵敏检测。该体系利用UCNPs作为近红外激发下的能量供体，AuNPs作为能量受体，通过发夹DNA（H1）实现二者的可控组装；在无靶标时，二者距离较近，发生FRET并使UCNPs的上转换发光（UCL）被猝灭；在miRNA-21存在时，靶标介导链置换反应并进一步触发CHA循环扩增，使AuNPs与UCNPs分离，从而恢复UCL。与此同时，带Cy5标记的H2引入稳定参考荧光信号，最终利用540 nm处UCNPs的可变UCL与670 nm处Cy5的稳定荧光构建比率型读出模式。研究表明，该策略可显著降低环境波动对检测结果的影响，提升体系的定量可靠性和抗干扰能力。

本研究的重要意义在于提出了一种兼具近红外激发、无酶扩增和双通道比率校正优势的miRNA检测平台。该方法不仅实现了对miRNA-21的高灵敏分析，还在血清样本中表现出良好的准确性与实用性，为核酸生物标志物的临床检测提供了新的技术思路。

研究人员开展本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过溶剂热法与种子介导生长法制备NaYF₄:20%Yb,4%Er,0.1%Tm及NaYF₄:20%Yb,4%Er,0.1%Tm@NaYF₄:20%Yb核壳上转换纳米颗粒，并通过配体交换实现柠檬酸修饰；其次利用Au–S键和酰胺键构建UCNP–H1–AuNP纳米探针；再通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证CHA反应可行性，并结合透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外-可见吸收光谱（UV-vis）、Zeta电位及荧光寿命分析对材料和FRET机制进行表征；最后在稀释血清样本中采用标准加入法进行实际样本分析。人血清样本来源于东南大学附属中大医院北院。

3.1. Characterization of the resultant UCNPs
研究人员首先合成了NaYF₄:20%Yb,4%Er,0.1%Tm核心UCNPs及NaYF₄:20%Yb,4%Er,0.1%Tm@NaYF₄:20%Yb核壳UCNPs，以保证后续FRET传感体系具备稳定的光学供体。通过透射电子显微镜（TEM）观察发现，核心颗粒呈高度单分散六方晶形，平均粒径为24.92 nm；形成壳层后，颗粒仍保持相似形貌，但平均粒径增至41.42 nm，表明壳层生长成功。能谱（EDS）结果显示Er、Y、Yb、Tm、F和Na等元素均匀分布，说明核壳结构构建有效。随后通过X射线衍射（XRD）证实所得颗粒均对应六方相NaYF₄，且未见立方相或其他杂质峰，说明晶体纯度较高。为提高水溶性和生物适用性，研究人员采用柠檬酸进行表面配体交换。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表明，油酸配体特征峰减弱或消失，同时羧基相关振动峰发生变化，证明柠檬酸已成功修饰于UCNPs表面。进一步通过紫外-可见吸收光谱（UV-vis）和Zeta电位分析确认H1已成功偶联至UCNPs表面，其中H1修饰后在260 nm处出现特征吸收，Zeta电位由Cit-UCNPs的?16.3 mV变化至UCNP–H1的?17.1 mV。偶联效率计算结果为52%，说明该探针构建具备可靠基础。

3.2. Characterization of AuNPs
在受体材料方面，研究人员采用柠檬酸还原法制备AuNPs，并对其结构与组成进行了系统表征。TEM结果显示AuNPs呈均匀球形分布，平均粒径约14.80 nm。高分辨图像中晶格条纹间距为0.23 nm，与金的（111）晶面间距一致。电子衍射图呈同心环分布，分别对应面心立方（face-centered cubic，FCC）金晶体的（111）、（200）、（220）和（311）晶面，表明所得AuNPs具有多晶结构。EDS结果进一步确认材料中存在Au元素。这些结果共同证明AuNPs已成功制备，可作为高效FRET能量受体用于后续传感体系。

3.3. Principle and feasibility of the proposed assay for the detection of miRNA-21
本节重点阐述并验证了检测体系的工作原理。研究人员设计了一条双功能发夹DNA H1，其5′端和3′端分别带有巯基与氨基，可同时连接AuNPs和UCNPs，形成FRET供受体对。在初始状态下，H1维持发夹构象，AuNPs与UCNPs距离较近，使UCNPs的UCL被有效猝灭。当miRNA-21识别H1环区后，触发链置换反应并打开H1，暴露出茎区中隐藏的引发序列，该序列进一步与Cy5标记的H2杂交，启动CHA循环。每轮CHA反应均生成稳定的H1–H2双链并释放miRNA-21，使其继续作为可循环触发因子参与后续扩增，从而实现信号放大。随着H1–H2双链形成，AuNPs与UCNPs空间分离，FRET被抑制，540 nm处UCL逐渐恢复；同时，670 nm处Cy5发出稳定参考荧光，最终构成双通道比率型检测模式。

研究人员通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证CHA反应的可行性。不同寡核苷酸体系的条带迁移差异表明，miRNA-21可与H1结合形成新复合物，且在H2存在时进一步形成迁移更慢的双链结构，证明CHA反应能够按设计发生。为验证FRET基础，研究人员比较了AuNPs的紫外吸收与UCNPs的发射光谱，发现二者在450–600 nm区间具有良好重叠，为能量转移提供了必要条件。荧光光谱结果表明，UCNP–H1与AuNPs连接后UCL明显降低，而加入miRNA-21后UCL恢复；进一步加入H2后，恢复程度更高，说明CHA确实实现了信号放大。荧光寿命分析显示，加入AuNPs前后，UCNPs寿命由589 μs缩短至238 μs，这一供体寿命缩短特征与FRET机制一致。与此同时，Cy5在670 nm处荧光强度在检测过程中变化不明显，证实其可作为稳定内参。由此证明所构建比率型荧光探针具有良好的机制可行性与抗环境干扰能力。

3.4. Optimization of detection conditions for miRNA-21
为获得最佳检测性能，研究人员对若干关键实验参数进行了优化，包括AuNPs加入量、H2浓度及反应时间。结果显示，随着AuNPs用量增加，UCL强度逐步下降，并在125 μL时达到最低值，说明该条件下FRET猝灭最充分，因此确定125 μL为最优AuNPs用量。对于H2浓度，随着其增加，UCL恢复信号逐步增强，并在超过20 nM后趋于稳定，表明CHA反应所需辅助探针已达到足量，故后续实验选择20 nM。时间优化结果显示，检测体系的UCL信号随反应时间延长而逐渐增强，在105 min达到平台，说明CHA反应基本完成，因此将105 min设定为最佳反应时间。通过上述优化，研究人员建立了具有较好灵敏度和稳定性的检测条件。

3.5. Analytical performance of the developed assay
在优化条件下，研究人员评估了所建方法的分析性能。随着miRNA-21浓度升高，540 nm处UCNPs的UCL逐渐恢复，说明靶标可有效触发探针结构变化并解除FRET猝灭；而670 nm处Cy5荧光几乎保持不变，进一步证明其具备良好的内参作用。基于此，研究人员建立了荧光强度比值F_UCNP/F_Cy5与miRNA-21浓度之间的定量关系。在0.5–25 pM范围内，二者呈显著线性相关，回归方程为Y = 0.6259 + 0.01352X，R² = 0.9985。依据3σ法则计算，检出限为0.28 pM。论文同时指出，该方法检出限低于若干既往报道的miRNA检测策略，表明CHA无酶扩增与UCNP/AuNP高效FRET耦合有助于提升检测灵敏度。相较依赖酶促反应的复杂体系，该平台采用无酶CHA扩增，操作流程更简化，且减少了靶标识别与信号转导过程中的干扰风险；相较其他荧光材料，UCNPs在近红外激发下背景低、假阳性风险小、光学稳定性优良，因此整体表现出较高的分析效能。

在选择性评估中，研究人员采用与急性心肌梗死相关且结构相近的其他miRNAs作为干扰分析对象，包括miRNA-141、miRNA-155、miRNA-1、miRNA-499及文中列举的其他对照miRNA。结果显示，这些非靶标miRNAs对应的UCL恢复均明显低于miRNA-21，说明体系对miRNA-21具有优异识别能力。研究人员认为，该高选择性来源于miRNA-21与H1探针之间的高亲和力杂交。稳定性研究进一步表明，在7天内以24 h间隔进行检测时，该传感器在PBS和血清体系中均维持较一致的响应，且经多次实验后仍具有可检测能力，说明该荧光生物传感器具有良好的操作稳定性。

3.6. Analysis of miRNA-21 in serum samples
为验证方法在实际生物样本中的适用性，研究人员将该生物传感器应用于血清加标样本检测。样本在检测前以PBS进行20倍稀释，随后采用标准加入法对miRNA-21进行定量分析。对于1.4 pM、6.0 pM和12 pM三个加标水平，测得回收率分别处于94.3–102.7%范围内，相对标准偏差（RSD）较低。上述结果说明，该方法在血清基质中具有较好的准确度与重复性，显示出实际样本分析潜力。

综合全文，研究人员通过构建UCNPs/AuNPs耦合的FRET传感体系，并引入miRNA-21触发的CHA无酶信号放大，实现了对低丰度miRNA-21的高灵敏检测。该体系充分利用UCNPs的反Stokes位移上转换发光特性，提高了信噪比；同时以Cy5为内参建立比率型检测模式，增强了抗环境干扰能力和定量稳定性。论文的讨论部分主要表明，该方法结合了纳米材料光学优势与核酸分子程序化扩增优势，在灵敏度、选择性和样本适用性方面均表现良好，但仍存在样本前处理相对复杂及暂不具备多靶标同步检测能力等局限。

研究结论部分可译为：本研究构建了一种高性能、高灵敏度的miRNA-21检测平台，该平台采用靶标触发的催化发夹组装（CHA）信号扩增以及上转换纳米颗粒（UCNPs）与金纳米颗粒（AuNPs）之间的荧光共振能量转移（FRET）机制。该传感器整合了CHA反应的信号放大作用和UCNPs的反Stokes位移上转换发光（UCL）特性，从而实现检测信号放大并提升信噪比。此外，通过以670 nm处Cy5的荧光强度作为内参，并结合540 nm处UCNPs的UCL强度变化，构建了比率型荧光生物传感器，可通过测定670 nm与540 nm处荧光强度比值来消除环境条件的影响。在优化实验条件下，该方法获得了1.25–25 pM的测定浓度区间以及0.28 pM的检出限。该研究实现了对miRNA-21的高灵敏、抗干扰检测；然而，该体系仍存在样本前处理较复杂以及缺乏多靶标检测能力等局限。未来工作应着重通过合理利用UCNPs的多波段UCL特性，提升该检测系统的临床应用价值，从而实现多种生物标志物的同步分析，并探索该荧光探针在活细胞成像中的应用。