动态细胞器图谱揭示酵母内质网应激下广泛的蛋白质定位重塑

《Nature Communications》：Dynamic Organellar Mapping in yeast reveals extensive protein localization changes during ER stress

本研究针对内质网（ER）应激条件下蛋白质亚细胞定位变化的系统性研究难题，开发了基于无标记质谱的动态细胞器图谱（DOMs）技术，发现数百种蛋白质在细胞区室间发生重定位，揭示了内质网滞留、ER回流、核孔复合体组成改变等新现象，为理解细胞应激响应机制提供了全新视角。

在细胞生物学研究领域，酿酒酵母作为重要的模式生物，其系统生物学研究技术日益成熟。然而，在蛋白质组水平上研究蛋白质亚细胞定位变化仍然面临巨大挑战。传统的高通量显微镜方法虽然能够比较不同条件下蛋白质的定位，但需要对蛋白质进行荧光标记，而标签可能影响标记蛋白的丰度、定位和功能。

内质网应激是细胞应对错误折叠蛋白质积累的一种状态，可激活未折叠蛋白质反应（UPR），增强蛋白质折叠和错误折叠蛋白质的降解。在酵母中，UPR诱导数百个基因表达，这些基因编码内质网驻留的蛋白质折叠和降解机制，也编码定位于分泌途径后内质网区室、线粒体、细胞质和细胞核的蛋白质。然而，此前的高通量显微镜研究仅发现25个蛋白质在内质网应激期间显示定位变化，这引发了一个问题：亚细胞定位变化是细胞适应内质网应激的一个较小方面，还是一个未被充分认识的方面？

为了回答这个问题，Heidelberg University Biochemistry Center的Anna Placzek、Klára Odehnalova等研究人员在《Nature Communications》上发表了题为"Dynamic Organellar Mapping in yeast reveals extensive protein localization changes during ER stress"的研究论文。

关键技术方法

研究人员建立了酵母动态细胞器图谱（DOMs）方法，通过酶法去除细胞壁和机械匀浆裂解细胞，差速离心获得亚细胞组分，利用无标记定量质谱技术分析各组分中蛋白质的丰度谱。通过支持向量机（SVM）算法将蛋白质分配到12个亚细胞区室，并开发了MR（运动-重现性）分析来识别蛋白质定位变化。研究使用DTT和衣霉素诱导ER应激，通过显微镜验证关键发现，并利用脉冲追踪实验和Western blotting进一步证实蛋白质定位变化。

研究结果

酵母DOMs空间蛋白质组学方法的建立

研究人员首先生成了未扰动酵母的稳态图谱。通过酶法去除细胞壁和机械匀浆裂解细胞，差速离心获得沉淀组分和上清液（胞质组分）。通过定量无标记质谱分析，获得了3910个蛋白质的分子/细胞丰度估计值，并定义了1908个蛋白质作为区室标记蛋白质。

主成分分析（PCA）显示区室标记物可重复聚类，表明DOMs方法能够在酵母中进行稳健的细胞器作图。应用训练的SVM预测所有2971个分析蛋白质的定位，结果显示与参考数据库有高度一致性。

应用DOMs研究细胞对ER应激的反应

研究人员使用DTT和衣霉素诱导ER应激，发现这两种药物引起了明显且可重现的蛋白质组改变。火山图分析显示，DTT引起1457个蛋白质的显著变化，衣霉素引起1183个蛋白质的显著变化，约占测量蛋白质组的三分之一，表明主要的蛋白质组重塑。

PCA显示，DTT引起内质网簇的显著移位，而衣霉素仅弱重现这一现象。核膜簇在DTT处理下主要跟随内质网移位，与内质网和核膜的物理连续性一致。MR分析在错误发现率<5%下，鉴定出DTT引起410个候选重定位蛋白质，衣霉素引起149个。

候选重定位蛋白质的实验验证

远离内质网的蛋白质

研究发现5种可溶性内质网腔蛋白（Cpr5、Sill、Fpr2、Pdi1和Kar2）在DTT和衣霉素处理下均显著向细胞质移位，这些是ER回流途径的候选货物蛋白。显微镜证实sfGFP标记的Sill和Pdi1在DTT处理期间重新分布到细胞质，而Ero1则不会。

此外，研究发现4个外周内质网膜蛋白和3个整合内质网膜蛋白（Rtn1、Yop1、Dpm1）在应激下向细胞质移位。四色成像显示Rtn1、Yop1和Dpm1在DTT诱导的点状结构中共定位，这些结构从一般的内质网中分离出来。

向内质网重新分布的蛋白质

研究鉴定出89个在应激期间向内质网重新分布的蛋白质，其中86个具有预测的跨膜结构域或内质网靶向信号肽，可能是整合膜或腔蛋白。这些蛋白质包括所有5个通过CPY途径靶向液泡腔的可溶性蛋白质，以及CPY途径中的两种分选受体。

研究还发现29个质膜或细胞壁蛋白质在应激诱导下向内质网移位，其中包括11个预测或验证的GPI锚定蛋白质。显微镜证实Gas1和Gas3在应激诱导下向ER重新分布，而成像脉冲追踪实验显示在ER应激期间合成的ss-sfGFP-Gas3大部分保留在ER中。

核孔蛋白和输入蛋白的重新分布

MR分析表明许多核膜蛋白有显著的定位变化，包括核孔复合体的大多数组成部分。10个预测远离核膜的核孔蛋白形成细胞质点状结构，而15个预测随核膜移位的核孔蛋白则不形成点状结构。

研究发现核输入受体Kap95在细胞质点状结构中与Nup116共定位，表明Kap95被隔离在细胞质中。相应地，带有核定位序列（NLS）的蛋白质的核输入在ER应激期间减慢，而被动扩散的蓝色荧光蛋白（BFP）的核质分布几乎不受影响。

研究结论与意义

本研究建立了酵母动态细胞器图谱（DOMs），并结合荧光显微镜探索了ER应激期间的蛋白质丰度和定位变化。使用DOMs作为后续成像实验的指导，能够进行系统性研究，表明蛋白质重定位是ER应激期间细胞重组的一个主要方面。

研究发现：（1）许多分泌途径蛋白质，特别是液泡蛋白质分选CPY途径的货物、GPI锚定蛋白质和高尔基体驻留甘露糖基转移酶，在内质网中积累，至少部分是由于错误折叠和内质网滞留；（2）部分但不是所有腔内内质网蛋白质重新分布到细胞质，使它们成为ER回流货物的候选者；（3）一部分整合内质网膜蛋白质，包括网状蛋白同源域蛋白质，共簇聚并与内质网的其余部分分离；（4）特定的核孔蛋白和输入蛋白形成共同的细胞质簇。

有趣的是，研究观察到许多应激响应蛋白质显示丰度或定位变化，但较少同时显示两者。这种趋势可能反映了一个更普遍的调控原则。

DOMs与量身定制的后续显微镜研究相结合具有几个优点：检测天然蛋白质，避免与标签相关的复杂问题；只需离心机和质谱仪即可生成DOMs；对未表征蛋白质的定位产生预测。DOMs的主要优势是检测蛋白质定位变化。

各种重定位蛋白质暗示了ER应激期间蛋白质组重塑的先前未知方面。例如，核孔蛋白的细胞质焦点已在酵母和后生动物中发现，可能反映了蛋白质凝聚物的形成。本研究系统性分析发现属于特定核孔亚复合体的许多核孔蛋白重新分布。一个可能性是细胞质核孔蛋白焦点源于孔复合体组装缺陷。长时间的内质网应激可能因通过内质网相关降解途径的通量增加而使蛋白酶体超载，并导致错误折叠蛋白质积累和细胞质中分子伴侣短缺。

总之，DOMs是一种可访问且强大的技术，可用于酵母蛋白质定位变化的无偏倚、全面研究。预计DOMs将加入不断增长的系统分析技术武器库，使酵母成为一个有启发性的模式生物。