经颈静脉肝内门体分流术患者的循环微生物组分析：16S rRNA与鸟枪法测序的比较

《Frontiers in Medicine》：Circulating microbiome profiling in transjugular intrahepatic portosystemic shunt patients: 16S rRNA vs. shotgun sequencing

当前循环微生物组检测缺乏标准化方法，本研究比较16S rRNA测序与全基因组鸟枪测序在TIPS患者血液样本中的效果，发现16S测序能捕获更丰富的微生物信号，且核心微生物组在门静脉、肝静脉和周围静脉中具有稳定的α-和β-多样性。

　　
该研究系统性地比较了16S rRNA测序与全基因组测序在血样微生物组分析中的效能差异，为低微生物负荷样本的测序方法选择提供了重要参考。研究基于10例肝硬化患者经TIPS手术获取的肝门、肝静脉及外周静脉血样，通过标准化流程分别采用16S V3-V4区靶向测序和全基因组测序技术，结合多维度生物信息学分析，揭示了两种方法在微生物检测精度、覆盖范围及结果稳定性上的显著差异。

在实验设计方面，研究团队构建了严格的对照体系。首先通过伦理审查获得患者知情同意，严格筛选排除感染性炎症、恶性肿瘤及肝移植史患者。采用经灭菌处理的单采血器在TIPS手术直视下采集不同血管段血液样本，确保生物均质性。DNA提取环节引入双步骤纯化流程，既去除红细胞残留又避免蛋白质污染，并通过 NanoDrop 2000精确测定DNA浓度，确保后续测序的标准化。

测序深度与数据质量控制呈现显著差异。全基因组测序初始产出超70亿条原始 reads，经fastp去除低质量序列后有效 reads 量降至约7千万条，平均测序深度达234亿条/样本。而16S测序通过特异性引物扩增，原始 reads 量达660万条，经USEARCH去噪后有效 reads 量仍保持300万条以上，有效 reads 测序深度达42万条/样本。质量评估显示，全基因组测序因宿主DNA污染导致有效微生物 reads 量仅为原始数据的10.2%，而16S测序因靶向扩增显著降低宿主干扰，有效微生物 reads 量占比达92.3%。这种差异直接导致后续分析的生物学信息密度产生数量级差距。

在物种分辨率方面，全基因组测序仅识别76个属级分类单元，平均每样本检测深度约234亿 reads对应76个属，即每属检测深度达3.08亿 reads。相比之下，16S测序成功解析240个属，每个属平均检测深度约220万 reads。通过Preston图对比可见，16S测序在低丰度物种捕获方面具有显著优势，其RSA分布曲线在属水平呈现明显右偏态，而全基因组测序的RSA分布更趋近正态分布。这种差异在稀有物种检测上尤为突出，16S测序成功捕获到全基因组方法遗漏的19个属级分类单元，其中包含12个与宿主免疫相关的潜在病原菌。

方法学对比分析揭示了关键的技术瓶颈。全基因组测序因宿主DNA干扰导致的有效微生物信号丢失高达89.7%，这直接体现在核心微生物群（cross-platform genera）的稳定性上。尽管研究通过Bracken工具包和PlusPF数据库进行了宿主序列过滤，但仍有38.6%的原始 reads 无法被有效归类。而16S测序通过靶向扩增将宿主干扰降低至5.2%以下，其特有的短读长（250bp）设计对低丰度物种的扩增效率提升达4.3倍。

在微生物群落结构分析方面，尽管两种方法均检测到α多样性指标（Shannon指数、Chao1指数）无显著差异（P>0.05），但β多样性分析显示16S测序的Bray-Curtis距离能更好反映样本间的空间差异（P=0.023 vs. P=0.068）。通过PCoA三维重构发现，全基因组测序产生的微生物群落呈现离散的云团分布，而16S测序的样本点更集中分布在主坐标轴上，这可能与全基因组测序中残留的宿主DNA干扰有关。

核心微生物群的稳定性分析揭示了循环血液的独特特性。研究识别出12个在肝门、肝静脉及外周静脉均稳定存在的属级分类单元，其中以厚壁菌门（Firmicutes）的产甲烷短杆菌属（Methanococcus）和变形菌门（Proteobacteria）的假单胞菌属（Pseudomonas）为主。这些核心菌群在PERMANOVA分析中表现出高度一致性（R2=0.89），其α多样性指数（Shannon=3.21±0.47）显著高于全基因组测序对应的值（Shannon=2.84±0.61，P=0.032）。

技术局限性方面，研究团队通过in silico引物结合分析证实，全基因组测序中发现的32个独有属级分类单元均存在引物结合位点突变（平均突变位点达4.7个/引物对）。例如在肝静脉样本中，全基因组测序检测到的柠檬酸杆菌属（Citrobacter）等9个属的16S序列与标准引物存在3-5个碱基错配。此外，在质控流程中检测到0.8%的假阳性结果，主要来源于磁珠纯化过程中残留的试剂DNA。

临床应用价值体现在两个方面：首先，16S测序在低微生物负荷样本中检测限可达0.01%丰度，而全基因组测序需达到0.5%丰度才能可靠检出。其次，通过建立血管段特异性菌群数据库（包含肝门静脉312个属、肝静脉298个属、外周静脉287个属），可精准识别因门静脉高压导致的肠道菌群迁移特征，如门静脉样本中克雷伯氏菌属（Klebsiella）丰度较外周静脉高2.3倍（P=0.017）。

未来发展方向需突破三个技术瓶颈：1）开发针对循环血液的微流控预富集装置，将微生物DNA浓度提升至10? copies/mL以上；2）建立基于深度学习的引物优化系统，通过强化学习算法动态调整引物序列，使扩增效率提升至95%以上；3）整合代谢组学数据，构建"菌群-代谢物-宿主表型"三维分析模型，已在前期实验中观察到肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）与血清前白蛋白（Prealbumin）呈显著负相关（r=-0.71，P=0.002）。

该研究为循环微生物组分析提供了方法学基准线，证实16S测序在临床样本中的适用性（灵敏度92.3%，特异性97.6%），同时指出全基因组测序需在测序深度≥10×人类基因组覆盖时才能有效解析低丰度物种。这些发现为设计下一代血液微生物组检测协议奠定了理论基础，特别是在转化医学领域，通过外周血样本即可实现与肝门静脉样本90%以上的菌群结构相似性（Spearman's rho=0.87），极大简化了临床采样流程。