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L50F等非活性位点突变对于恢复SARS-CoV-2主蛋白酶的病毒适应性至关重要。在这里,作者使用全长Mpro蛋白作为底物,并证明L50F可以促进酶-底物复合物的形成,从而促进nirmatrelvir耐药性。
新冠病毒主蛋白酶耐药机制新解:远端蛋白相互作用的关键角色
2025 年 2 月 1 日,美国南佛罗里达大学莫尔萨尼医学院分子医学系的 Eric M. Lewandowski 等人在《Nature Communications》杂志上发表了题为 “Distal protein - protein interactions contribute to nirmatrelvir resistance” 的论文。该研究深入探究了新冠病毒主蛋白酶(
)对 nirmatrelvir(Paxlovid 的活性成分)产生耐药性的机制,对于理解新冠病毒变异、开发更有效的抗病毒药物以及应对未来可能出现的耐药毒株具有至关重要的意义。
研究背景
自 2019 年末新冠疫情爆发以来,由 SARS-CoV-2 引发的疫情在全球范围内对健康、经济和社会造成了巨大影响。SARS-CoV-2 的主蛋白酶(
)在病毒复制过程中负责将病毒多聚蛋白切割成成熟的蛋白质,是抗新冠治疗的关键药物靶点,nirmatrelvir 能够有效抑制
。然而,
容易发生活性位点和非活性位点的突变,许多突变导致 SARS-CoV-2 变种对 nirmatrelvir 产生体外耐药性,在免疫功能低下的患者中也出现了耐药情况 。此前研究发现,携带
三重突变(L50F/E166A/L167F)的 SARS-CoV-2 病毒对 nirmatrelvir 高度耐药,但在细胞培养和动物模型中却显示出与野生型病毒相似的复制适应性 。L50F 突变位于远离
活性位点的区域,虽不直接参与与 nirmatrelvir 或常用生化分析底物的结合,却能挽救由活性位点突变(如 E166A、E166V)导致的病毒适应性下降 。目前,体外生化研究大多仅使用对应于病毒多聚蛋白上
切割位点的小肽底物,无法全面捕捉酶 - 底物(ES)复合物中活性位点外的蛋白质 - 蛋白质相互作用,这使得生化数据与病毒复制试验之间的差异难以解释,阻碍了对
耐药突变的理解和新抑制剂的开发。
研究材料与方法
融合蛋白构建与纯化
研究人员将
C145A(C145A/L50F)与艰难梭菌青霉素结合蛋白 3(PBP3)42 - 554 的融合蛋白插入 pETGSTSumo 载体,在
和 PBP3 42 - 554 之间插入切割位点 SAVKRT。将表达构建体转化到 Rosetta (DE3) pLysS 细胞中,经诱导表达、超声破碎、超速离心、亲和层析、标签去除和尺寸排阻层析等步骤纯化融合蛋白。
荧光凝胶分析
用 1.5 倍的 Bocillin 对纯化的无标签
C145A - PBP3 42 - 554 进行标记,然后与不同的
突变体孵育,反应结束后用不含染料的 2x SDS - PAGE 上样缓冲液终止反应,通过 ChemiDoc XRS + 和 ImageJ 软件分析蛋白条带强度,用 SigmaPlot 分析初始速率。
FRET 酶促分析
采用 Fmoc 固相肽合成法合成
nsp4 - 5 和 nsp5 - 6 FRET 底物。在优化的底物浓度下测定 SARS-CoV-2
突变体的
和
,通过监测荧光信号计算反应的初始速度。在测定
时,将优化浓度的突变体蛋白与 FRET 底物和不同浓度的 nirmatrelvir 混合,监测反应并计算
。
诱变、蛋白表达与纯化
使用 Agilent 的 QuikChange? II 定点诱变试剂盒,以 pET - SUMO -
质粒为模板生成
突变体。将质粒转化到 RosettaPlyss (DE3) 感受态细胞中,诱导表达后通过超声破碎、离心、亲和层析、标签去除和尺寸排阻层析等步骤纯化突变体蛋白。
结晶与结构测定
将
突变体稀释至 5mg/mL,采用悬滴法在特定条件下结晶,将晶体转移到含 20% 甘油的冷冻保护剂溶液中并在液氮中速冻。在阿贡国家实验室的先进光子源(APS)的 19 - ID 光束线收集 X 射线衍射数据,用 HKL - 3000 和 CCP4 处理数据,PHASER 进行分子置换,CCP4 套件、Coot 和 PDB REDO 服务器进行模型构建和结构精修。
埋藏表面积计算
使用 VMD 程序的最大速度分子表面算法计算孤立二聚体的总溶剂可及表面积(SASA)和与相邻二聚体相关的特定 SASA,计算二聚体 - 二聚体埋藏表面积(ddBSA)并取平均值。
研究技术路线
研究人员首先构建了含有特定突变的
融合蛋白,利用荧光凝胶分析和 FRET 酶促分析,分别以蛋白底物和小肽底物检测不同
突变体的催化活性以及对 nirmatrelvir 的耐药性。通过 X 射线晶体学解析
L50F/E166A/L167F 三重突变体和 L50F 单突变体的晶体结构,观察分子间和分子内的相互作用。结合结构信息和酶活性数据,深入分析远端突变对
活性、底物结合以及耐药性的影响机制。
研究结果
远端突变对 活性的影响(使用蛋白质底物)
在病毒多聚蛋白的 11 个位点进行切割,研究人员推测其切割病毒多聚蛋白的限速步骤是从病毒多聚蛋白中自我切割,即
N 端的 nsp4 - 5 序列和 C 端的 nsp5 - 6 序列的切割。通过基于荧光电泳的测定方法,以含有 nsp5 - 6 切割序列的
蛋白底物进行实验,发现与使用小肽底物(nsp4 - 5 和 nsp5 - 6 FRET 肽)的实验相比,L50F 在使用蛋白底物(
C145A 和 C145A/L50F 融合蛋白)时对
酶活性的影响显著更大。
L50F 在切割 C145A
蛋白底物时比野生型活性高 3.1 倍,而在切割 nsp5 - 6 和 nsp4 - 5 FRET 底物时分别比野生型高 1.9 倍和 1.7 倍。L50A 突变体在切割蛋白底物时活性略低于野生型,在切割肽底物时活性略高于野生型。E166A、L167F 单突变体和 E166A/L167F 双突变体在切割 nsp5 - 6 肽和蛋白底物时酶活性均降低,在切割 nsp4 - 5 FRET 肽底物时酶活性下降更明显。L50F 能够挽救 E166A/L167F 双突变体降低的酶活性,L50F/E166A/L167F 三重突变体在切割 C145A
蛋白底物时活性略高于野生型。T21I 在肽分析中对酶活性影响不显著,在模拟 C 端切割的蛋白底物分析中,其活性与野生型相似。
L50F/E166A/L167F 三重突变体晶体结构
三重突变体结晶在
空间群,晶体衍射分辨率为 2.23 ?。突变的 F50 残基侧链位于二聚体 - 二聚体界面,嵌入相邻二聚体中由 V212、L220、T257 和 I259 形成的疏水口袋。相邻二聚体中
原聚体的 C 端从催化口袋底部进入含有 F50 的
蛋白的活性位点,这表明三重突变体晶体结构捕获了
自我切割的产物复合物,L50F 突变可能促进蛋白质 - 蛋白质相互作用,有利于 C 端底物肽在活性位点的定位以便切割。此外,还观察到分子内 C 端与含有 Q256 的螺旋之间的相互作用,这些相互作用形成了新的 S3 位点来容纳 T304,有助于解释 T304I 耐药突变的机制。与野生型相比,三重突变体活性位点口袋明显变宽,这可能与 E166A 突变有关,较小的丙氨酸侧链避免了潜在的空间位阻,也解释了 L50F 与 E166A/L167F 突变之间的协同作用。L167F 也对 nsp5 - 6 底物的结合有贡献,V303 与 F167 之间的相互作用比与 L167 更多,这可能是 L167F 在使用两种肽底物时活性变化差异的原因。
L50F 单突变体晶体结构
L50F 单突变体晶体结构分辨率为 2.21 ?,F50 侧链参与广泛的分子间疏水相互作用,有助于将相邻原聚体的 C 端放置在活性位点。与三重突变体结构相比,存在一些差异。在 L50F 单突变体结构中,两个相互作用的二聚体具有伪二重对称性,F50 在两个二聚体 - 二聚体界面参与的疏水相互作用与三重突变体不同。
底物 C 端在活性位点采用非规范构象,底物从活性位点侧面进入,P3 - P5 侧链与酶活性位点水平。这种构象可能不代表肽键切割后的产物构象,可能需要额外的构象变化才能进行反应。L50F 单突变体结构可能代表酶与底物蛋白的初始相遇状态,而之前发表的 L50F 结构(PDB 8DKZ)可能代表有效 ES 复合物中的构象。L50F 单突变体结构和之前发表结构的二聚体 - 二聚体界面埋藏表面积不同,进一步证明 L50F 突变增强了蛋白质 - 蛋白质相互作用。此外,T21I 和 P252L 等突变也可能影响 ES 复合物中的蛋白质 - 蛋白质相互作用,多个耐药突变位于二聚体 - 二聚体界面,表明该界面在耐药机制中具有重要生物学意义。
研究结论与讨论
该研究表明,远离
活性位点的远端蛋白质 - 蛋白质相互作用对底物结合有显著贡献,这些位置的突变可以显著改变
的活性和病毒复制的适应性。研究为 L50F 在促进
蛋白质 - 蛋白质相互作用以及恢复由活性位点耐药突变(如 E166A/L167F)导致的酶活性降低方面的作用提供了结构解释。除了
的自我切割,像 L50F 这样的突变可能还会增强
与病毒多聚蛋白上其他 nsp 蛋白之间的相互作用。研究结果强调了在研究
耐药突变时,需要针对不同切割位点,研究耐药突变对活性位点内外特定酶 - 底物相互作用的影响,而不是仅使用一种通用的肽底物。未来还需要分析耐药突变对
N 端自我切割以及病毒多聚蛋白上其他切割位点的影响。
这项研究的重要意义在于,为深入理解 SARS-CoV-2 对 nirmatrelvir 的耐药机制提供了关键线索,有助于科学家开发更有效的抗新冠病毒药物,以应对不断变异的病毒毒株,对全球公共卫生领域抗击新冠疫情具有重要的理论指导价值,为后续的药物研发和疫情防控策略调整提供了重要的参考依据。