METTL3通过靶向ATG7调控缺氧诱导的心肌细胞自噬

　　

METTL3 调控缺氧诱导心肌细胞自噬的研究解读

复旦大学附属中山医院等多单位的研究人员 Linnan Li、Hao Cheng 等人在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “METTL3 regulates autophagy of hypoxia - induced cardiomyocytes by targeting ATG7” 的论文。该研究揭示了 METTL3 在缺血缺氧心肌细胞自噬调节中的关键作用，为深入理解急性心肌梗死（AMI）的发病机制以及开发新的防治策略提供了重要理论依据，对心血管疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景

急性心肌梗死（AMI）作为常见心血管疾病，是全球主要致死病因之一。尽管现有药物和介入治疗取得一定进展，但有效治疗手段仍匮乏，深入探究 AMI 发病机制迫在眉睫。

表观遗传学是指在不改变 DNA 序列的情况下对基因表达进行调控，其中 RNA 甲基化是真核生物 mRNA 内部最常见的甲基化修饰。它主要通过调节 mRNA 稳定性、剪接、核转运、翻译和降解来调控蛋白质表达。甲基化由甲基转移酶（writers）、结合蛋白（readers）和去甲基酶（erasers）三类蛋白调控，METTL3 作为甲基转移酶复合物的关键成分，在心血管疾病中发挥重要作用，但它与 AMI 之间的潜在机制尚不清楚。

自噬是真核生物中一种进化保守的机制，在维持细胞生长、存活和内环境稳定方面至关重要。自噬失调与多种疾病相关，包括心血管疾病。已有研究表明， RNA 甲基化可影响自噬相关基因表达进而调节自噬，但 METTL3 对缺血缺氧心肌细胞自噬的调控机制在 AMI 背景下仍不明确。本研究旨在探究 METTL3 介导的 RNA 甲基化修饰在缺血缺氧心肌细胞自噬中的作用及相关机制。

二、研究材料与方法

（一）细胞培养与处理

选用 H9c2 大鼠心肌细胞系、AC16 人心肌细胞系和新生大鼠心肌细胞（NRCMs）。H9c2 和 AC16 细胞培养于含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的高糖 DMEM 培养基中；NRCMs 培养于含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的 DMEM - F12 培养基中。通过更换无血清无葡萄糖 DMEM 培养基并置于含 95% 和 5% 的缺氧培养箱中构建缺血缺氧模型，H9c2 细胞缺氧 3 小时，NRCMs 细胞缺氧 6 小时。

（二）细胞转染、质粒和 RNA 干扰

使用重组腺病毒（Ad - METTL3、Ad - mCherry - EGFP - LC3、Ad - NC）、构建于 pcDNA3.1 载体的 ATG7 基因序列以及 METTL3 siRNA、ATG7 siRNA、YTHDF1 siRNA、YTHDF2 siRNA、YTHDF3 siRNA 和阴性对照 siRNA 进行细胞转染实验。利用 Lipofectamine 3000 试剂转染 siRNA 48 小时，腺病毒感染细胞 48 小时。

（三）实验动物及模型构建

选用新生雄性 SD 大鼠和 6 - 8 周龄 C57bl/6 小鼠，构建条件性诱导心脏特异性 METTL3 敲除小鼠（METTL3 - CKO），通过心脏原位注射 AAV9 腺相关病毒构建 METTL3 过表达、ATG7 过表达或 ATG7 敲低的小鼠模型。采用 2.0% 异氟烷麻醉小鼠，气管插管机械通气后，结扎左前降支构建心肌梗死模型，假手术组不进行结扎。

（四）检测方法

运用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析细胞和组织中蛋白质水平；实时荧光定量 PCR（qPCR）检测 mRNA 表达水平；CCK - 8 法评估细胞活力；免疫荧光分析观察自噬体形成；透射电镜（TEM）观察自噬体结构；LC - MS/MS 技术检测修饰水平；SELECT 技术检测 ATG7 mRNA 的位点；RNA 免疫沉淀 - qPCR（RIP - qPCR）分析蛋白与 RNA 的相互作用；mRNA 稳定性分析检测 mRNA 转录水平变化。实验数据以均值 ± 标准差表示，采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析，具有统计学意义。

三、研究技术路线

首先，通过在缺氧条件下处理 H9c2 细胞和 NRCMs 细胞，观察 METTL3 和自噬相关蛋白的表达变化，确定缺氧处理时间。接着，对 H9c2 细胞进行 METTL3 敲低和过表达处理，检测自噬水平变化，在 NRCMs 和 AC16 细胞中进行验证，探究 METTL3 对心肌细胞自噬的调控作用。然后，利用自噬抑制剂和激动剂处理细胞，观察 METTL3 通过自噬对缺氧心肌细胞损伤的影响。之后，筛选 METTL3 调控自噬的潜在靶基因，验证 ATG7 与 METTL3 的关系并进行拯救实验。进一步探究 METTL3 对 ATG7 mRNA 的修饰作用，确定 YTHDF2 在其中的介导作用。最后，在体内构建小鼠模型，验证 METTL3 通过 ATG7 依赖的自噬调控心肌梗死损伤和心脏功能。

四、研究结果

（一）METTL3 调节缺氧诱导心肌细胞的自噬

研究人员在不同缺氧时长处理的 H9c2 细胞和 NRCMs 细胞中，通过 Western blot 分析发现，METTL3 和自噬相关蛋白水平先升后降，H9c2 细胞在缺氧 3 小时、NRCMs 细胞在缺氧 6 小时时自噬水平达到峰值，据此确定后续缺氧实验时间。免疫荧光染色显示 METTL3 主要定位于细胞核。在功能研究中，敲低 METTL3 使 H9c2 细胞中 LC3B - II/LC3B - I 比值和 Beclin - 1 表达增加，SQSTM1 水平降低；过表达 METTL3 则结果相反。免疫荧光和透射电镜分析表明，敲低 METTL3 增加 LC3 斑点形成和自噬体数量，过表达则减少，在 NRCMs 和 AC16 细胞中得到类似结果，证明 METTL3 负向调控心肌细胞自噬激活。

（二）METTL3 通过自噬影响缺氧心肌细胞的损伤

使用自噬抑制剂 Bafilomycin - A1 处理 H9c2 细胞和 NRCMs 细胞，发现敲低 METTL3 至少在自噬早期通过促进自噬体形成诱导自噬。转染 mCherry - EGFP - LC3 腺病毒进行免疫荧光分析，结果显示敲低 METTL3 后黄色和红色颗粒显著增加。用自噬激动剂 Rapamycin 和抑制剂 3 - MA 处理 H9c2 细胞，发现 Rapamycin 增加自噬通量，提高细胞活力并降低凋亡水平；3 - MA 则相反。表明敲低 METTL3 通过促进自噬通量保护心肌细胞免受缺氧诱导的损伤。

（三）METTL3 通过靶向 ATG7 影响自噬

通过 RT - qPCR 分析缺血缺氧 H9c2 细胞中自噬相关基因 mRNA 表达，发现敲低 METTL3 显著增加 ATG7 mRNA 水平，过表达则降低。Western blot 结果显示，在 H9c2 细胞、NRCMs 细胞和 AC16 细胞中，METTL3 敲低和过表达分别改变 ATG7 蛋白水平，而其他一些自噬相关蛋白及转录因子无显著变化。敲低 ATG7 使 H9c2 细胞中 LC3B - II/LC3B - I 比值降低、p62 增加，抑制细胞活性。拯救实验表明，敲低 ATG7 可逆转敲低 METTL3 对自噬相关蛋白的影响，过表达 ATG7 可逆转过表达 METTL3 的作用，证实 METTL3 通过介导 ATG7 调节自噬。在不同诱导自噬条件下，METTL3 对自噬的影响存在差异。

（四）METTL3 以依赖的方式调节 ATG7 mRNA 表达

运用 LC - MS/MS 技术检测发现，敲低 METTL3 的 H9c2 细胞在缺血缺氧条件下修饰水平降低。通过生物信息学分析预测 ATG7 mRNA 的修饰位点，利用 SELECT 技术证实缺氧增加相应位点修饰的 ATG7 mRNA 含量，敲低 METTL3 则减少。RIP - qPCR 实验证明 METTL3 与 ATG7 mRNA 相互作用，缺氧和 METTL3 过表达增强这种结合。mRNA 稳定性分析显示，敲除 METTL3 延长 ATG7 mRNA 转录本的下降和稳定性，表明 METTL3 靶向 ATG7 转录并以依赖的方式调节其表达，进而调节自噬。

（五）YTHDF2 通过依赖的机制介导 ATG7 的 mRNA 表达

分别敲低 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 的 mRNA 表达，发现只有敲低 YTHDF2 显著提高各缺氧时间点的 ATG7 蛋白水平，RT - qPCR 在转录水平也证实该结果。拯救实验表明，敲低 YTHDF2 可逆转过表达 METTL3 对 ATG7 和自噬相关蛋白的影响。RIP - qPCR 实验进一步证实缺氧处理的 H9c2 细胞中 ATG7 mRNA 与 YTHDF2 相互作用，mRNA 稳定性分析显示敲除 YTHDF2 延长 ATG7 mRNA 转录本的下降和稳定性，说明 YTHDF2 通过依赖的机制调节 ATG7 的 mRNA 表达。

（六）METTL3 通过 ATG7 依赖的自噬在体内调节心肌梗死诱导的心脏损伤

构建小鼠心肌梗死模型，发现术后第一周自噬信号最强，随后下降。构建 METTL3 - CKO 小鼠和 METTL3 过表达小鼠模型，结果显示，METTL3 过表达小鼠心脏组织中 LC3B - II/LC3B - I 和 ATG7 蛋白表达降低，p62 表达增加，自噬水平受抑制；METTL3 - CKO 小鼠则相反。在 METTL3 - CKO 小鼠中敲低 ATG7 可逆转自噬水平升高的现象。超声心动图和组织学分析表明，敲低 METTL3 可改善心脏功能，减少心肌梗死面积和纤维化，敲低 ATG7 可逆转这些效果。过表达 ATG7 可在一定程度上改善心肌梗死小鼠的心脏功能。

五、研究结论

本研究表明，METTL3 负向调控缺血缺氧心肌细胞的自噬，ATG7 是 METTL3 调控自噬的关键靶基因。缺氧条件下，METTL3 缺失导致 ATG7 mRNA 的修饰水平降低，减少其被 YTHDF2 识别和结合，使 ATG7 蛋白翻译增加，增强自噬水平，促进缺血缺氧心肌细胞存活。

六、讨论

本研究揭示了 METTL3 在缺血缺氧心肌细胞自噬调控中的重要作用，但也存在一定局限性。研究主要聚焦于 ATG7，其他与 METTL3 相关的自噬因子有待进一步探索；研究仅基于细胞和动物实验，缺乏临床样本支持；METTL3 介导 ATG7 的甲基化机制在不同环境或细胞中的表现尚未完全明确。未来需针对这些方面深入研究，以更全面地理解修饰在缺血性心脏病中的作用机制，为急性心肌梗死的防治提供更有效的策略。

尽管存在局限，该研究仍具有重要意义。它首次明确了 METTL3 - ATG7 - 自噬轴在缺血缺氧心肌细胞中的调控机制，为心血管疾病研究提供了新的理论依据。修饰参与缺血性心脏病的病理生理过程，对维持心脏正常结构和功能至关重要，该研究为后续深入探究修饰在心血管疾病中的作用指明了方向，有助于开发针对急性心肌梗死的新型诊断和治疗方法。