plc2o2的hras结合C2结构域抑制类风湿关节炎患者的肿瘤样滑膜细胞和实验性关节炎

【字体: 时间:2025年02月04日 来源:Experimental & Molecular Medicine 9.5

编辑推荐:

  

  

类风湿关节炎研究新突破:PLCη2 的关键作用及治疗潜力


近日,来自庆尚国立大学医学院内科风湿病学系等多个单位的研究人员在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “The HRAS-binding C2 domain of PLCη2 suppresses tumor-like synoviocytes and experimental arthritis in rheumatoid arthritis” 的论文。该研究在类风湿关节炎(RA)的发病机制及治疗靶点探索方面取得了重要进展,为 RA 的治疗提供了新的方向和理论依据。

一、研究背景


类风湿关节炎是一种典型的自身免疫性疾病,其发病过程涉及免疫细胞与基质细胞之间的复杂相互作用,最终导致关节破坏和严重残疾。尽管目前针对 RA 的治疗取得了一定进展,主要是免疫细胞靶向药物,但仍有相当一部分患者病情难以控制,且许多患者因全身免疫抑制带来的感染和恶性肿瘤风险而停止治疗。

成纤维样滑膜细胞(FLSs)作为关节内主要的基质细胞,在 RA 的炎症持续和关节破坏中发挥着关键作用。它们不仅具有免疫激活功能,还表现出类似癌细胞的侵袭性行为。因此,靶向 RA FLSs 成为治疗 RA 的一个重要方向,有望弥补现有疗法的不足,减轻全身免疫抑制带来的副作用。

在蛋白质结构中,C2 结构域广泛存在于多种蛋白质中,具有结合多种配体和底物的能力,在细胞信号转导、膜运输和结构支持等方面发挥着重要作用。已有研究发现,一些含有 C2 结构域的蛋白质在癌症组织中表达异常,并与肿瘤的发生发展相关。鉴于 RA FLSs 与癌细胞在增殖、存活等方面存在相似性,深入研究 C2 结构域在调节 RA FLSs 功能中的作用,对于揭示 RA 的发病机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。

二、研究材料和方法


  1. 细胞培养与组织获取:研究人员从接受滑膜切除术的 RA 患者废弃滑膜组织中获取原代 FLS 细胞系,并培养 MH7A 滑膜成纤维细胞系。细胞培养于含 10% 胎牛血清和抗生素 - 抗真菌溶液的培养基中,实验前检测支原体污染并进行血清饥饿同步化处理。
  2. 病毒载体构建与转染:利用 Gateway 腺病毒系统构建包含 144 个不同 C2 结构域的腺病毒载体库,编码 GFP 融合的 C2 结构域。通过 RT - PCR 扩增人 PLCη2 的 C2 结构域(PLCη2_C2),构建 Ad - PLCη2 和 Ad - PLCη2_C2 载体。同时,使用 OmicsLink 表达质粒和 shRNA 克隆进行 PLCη2 的过表达和敲低实验。
  3. 高通量筛选与功能检测:运用基于功能性 C2 结构域组学的高通量筛选技术,评估不同 C2 结构域对 RA FLSs 增殖和 NF - κB 激活的影响。采用 Cell Counting Kit - 8(CCK - 8)和 MTT 法检测细胞增殖和活力,通过分泌型荧光素酶报告基因检测 NF - κB 信号活性。
  4. 体内实验:利用 SCID 小鼠共植入模型评估 RA FLSs 对软骨的侵袭能力;通过体内 Matrigel 栓塞实验和 TUNEL 染色检测 FLS 细胞凋亡;构建胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型,关节腔内注射腺病毒,观察疾病严重程度和病理变化。
  5. 分子机制研究:进行 Ca2?成像、双分子荧光互补(BiFC)分析和免疫共沉淀(co - IP)实验,研究 PLCη2 和 PLCη2_C2 与 HRAS 的相互作用及对下游信号通路的影响;运用磷酸化蛋白质阵列检测信号通路中相关分子的磷酸化水平。

三、研究结果


  1. 功能性 C2 结构域组学筛选确定 PLCη2_C2 为 RA FLSs 的调节因子:研究人员利用高通量筛选方法,对 144 个不同 C2 结构域进行筛选,发现 PLCη2_C2、SYTL5_C2 和 SYT4_C2 的 C2 结构域可降低 IL - 1β 诱导的增殖和 TG 诱导的细胞死亡。其中,PLCη2_C2 对人 RA FLS 细胞系 MH7A 的增殖和 NF - κB 活性影响最为显著。
  2. PLCη2_C2 抑制原发性 RA FLSs 的过度增殖和侵袭性表型:通过腺病毒介导的 PLCη2_C2 过表达实验,发现其可显著降低原发性 RA FLSs 的增殖,促进 TG 诱导的细胞死亡,抑制细胞迁移和侵袭能力,并减少促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的表达和分泌。
  3. RA 患者滑膜组织和 FLSs 中 PLCη2 表达下调:免疫荧光和免疫印迹分析显示,RA 患者滑膜组织和 FLSs 中 PLCη2 蛋白表达显著低于骨关节炎(OA)患者。刺激 RA FLSs 后,Plch2 mRNA 和 PLCη2 蛋白表达均下降。
  4. PLCη2 负向调节 RA FLSs 的过度增殖和侵袭性表型:在 OA FLSs 中敲低 PLCη2 可促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞死亡;在 RA FLSs 中过表达 PLCη2 则产生相反效果。体内实验也证实,PLCη2 和 PLCη2_C2 可抑制 RA FLSs 对软骨的侵袭,促进细胞凋亡。
  5. PLCη2 和 PLCη2_C2 以 Ca2?非依赖方式驱动 RA FLSs 的病理信号传导:通过 Ca2?成像和相关实验表明,PLCη2_C2 与质膜的结合不依赖于 Ca2?,且 PLCη2 的活性在 RA FLSs 中也不依赖于 Ca2?。
  6. PLCη2 和 PLCη2_C2 与 HRAS 相互作用:通过数据库搜索、BiFC 和 co - IP 实验证实,PLCη2 和 PLCη2_C2 与 HRAS 在细胞质中相互作用。PLCη2 与 HRAS 结合后,抑制 RAF1 结合,降低 HRAS 活性,下调 NF - κB、JAK - STAT 和 MAPK 等下游信号通路的磷酸化水平。
  7. PLCη2 和 PLCη2_C2 对 CIA 小鼠具有治疗作用:在 CIA 小鼠模型中,关节腔内注射 Ad - PLCη2 或 Ad - PLCη2_C2 可显著降低疾病临床评分,减轻后爪肿胀,改善踝关节病理变化,降低关节组织中细胞因子、MMPs 和趋化因子的 mRNA 表达水平。

四、研究结论


本研究表明,PLCη2 在 RA 的病理生理过程中发挥着重要作用,其在 RA FLSs 中的表达低于 OA FLSs。体内外实验充分证明,PLCη2 及其 C2 结构域能够调节 RA FLSs 的炎症和侵袭性表型,抑制 RA 的发展和进展。

具体而言,PLCη2 以 Ca2?非依赖的方式发挥作用,通过与 HRAS 特异性结合,抑制其活性,进而下调 MAPK - ERK、JAK - STAT 和 NF - κB 等关键下游信号通路。这些发现揭示了 PLCη2 作为潜在的上游调节因子,对 RA 具有广泛的抑制作用,为 RA 的治疗提供了新的潜在靶点。

五、讨论


该研究首次深入探究了 PLCη2 及其 C2 结构域在 RA 中的作用机制,为理解 RA 的发病机制提供了新的视角。此前,虽然已知一些 C2 结构域蛋白在癌症和炎症性疾病中起作用,但 PLCη2 在 RA 中的功能尚不明确。本研究通过全面的体内外实验,填补了这一空白。

从治疗角度来看,目前针对 RA 的治疗主要集中在免疫细胞靶向药物,但存在诸多局限性。本研究发现 PLCη2 和 PLCη2_C2 能够有效抑制 RA FLSs 的异常行为,提示它们可能成为治疗 RA 的新靶点,为开发更有效的治疗策略提供了理论依据。

然而,该研究也存在一定的局限性。在体内实验中,虽然关节腔内注射 Ad - PLCη2 在 CIA 小鼠中显示出治疗效果,但难以完全排除对滑膜巨噬细胞或免疫细胞的影响。未来的研究需要进一步明确其在体内的具体作用机制和靶点特异性,优化治疗方案,提高治疗效果。

总体而言,该研究成果为 RA 的治疗开辟了新的方向,有望推动针对 RA FLSs 的靶向治疗发展,为众多 RA 患者带来新的希望。后续研究可在此基础上,进一步深入探究 PLCη2 及其 C2 结构域的作用机制,开发相关药物,验证其在人体中的疗效和安全性,为 RA 的临床治疗提供更有效的手段。

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号