PLCn2的C2结构域通过抑制HRAS-RAF1互作调控类风湿关节炎中肿瘤样滑膜细胞的恶性表型

推荐语： 本研究针对类风湿关节炎(RA)中成纤维样滑膜细胞(FLSs)的肿瘤样表型和免疫激活特性，通过功能C2结构域组学筛选发现PLCn2的C2结构域(PLCn2_C2)能显著抑制FLSs的增殖、迁移和炎症反应。机制上，PLCn2_C2以钙离子(Ca2+)非依赖方式破坏HRAS-RAF1相互作用，进而抑制NF-κB、JAK-STAT和MAPK通路。该成果为靶向FLSs的RA治疗提供了新策略，发表于《Experimental & Molecular Medicine》。

　　

类风湿关节炎(RA)作为一种典型的自身免疫性疾病，其核心病理特征之一是关节滑膜中成纤维样滑膜细胞(FLSs)的异常活化。这些细胞不仅表现出类似肿瘤细胞的侵袭性生长特性，还能通过分泌促炎因子和基质金属蛋白酶(MMPs)加剧关节破坏。尽管当前以免疫细胞为靶点的生物制剂取得了一定疗效，但约30%患者仍面临治疗抵抗或药物毒副作用。因此，寻找直接调控FLSs病理行为的新靶点成为RA研究的重要方向。

在这一背景下，庆尚国立大学的研究团队将目光投向了C2结构域——这是一类广泛参与细胞信号转导和膜运输的蛋白质功能模块。通过构建包含144种C2结构域的腺病毒载体库，研究人员采用高通量功能筛选技术，首次发现磷脂酶Cn2(PLCn2)的C2结构域能显著抑制FLSs的恶性表型。进一步实验证实，PLCn2在RA患者滑膜组织中表达显著降低，其过表达可抑制FLSs增殖、迁移和侵袭能力，并增强细胞对凋亡诱导剂的敏感性。在胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型中，局部注射PLCn2_C2腺病毒能有效减轻关节肿胀和骨侵蚀。

研究采用的关键技术包括：1)基于Gateway克隆系统的C2结构域腺病毒文库构建；2)CCK-8和Transwell实验评估细胞增殖与侵袭；3)双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(co-IP)验证蛋白互作；4)磷酸化蛋白芯片分析信号通路；5)SCID小鼠人软骨植入模型和CIA模型进行体内验证。样本来源于接受滑膜切除术的RA患者原代FLSs。

主要研究结果
功能性C2结构域组学筛选鉴定PLCn2_C2为RA FLSs调控因子
通过IL-1β诱导的增殖实验和TNF-α激活的NF-κB报告基因检测，从144个C2结构域中筛选出PLCn2_C2、SYTL5_C2和SYT4_C2三个候选分子。其中PLCn2_C2对FLSs的增殖抑制和凋亡促进作用最为显著。

PLCn2_C2抑制原代RA FLSs的过度增殖和侵袭表型
过表达PLCn2_C2可降低RA FLSs的增殖速率（CCK-8检测显示抑制率达42%），增强毒胡萝卜素(TG)诱导的凋亡（MTT法显示存活率下降35%）。划痕实验和Transwell实验分别证实其迁移和侵袭能力被抑制58%和67%。qPCR显示IL-6、MMP3等炎性因子表达显著下调。

RA患者中PLCn2表达下调
免疫印迹显示RA滑膜组织中PLCn2蛋白水平较骨关节炎(OA)组降低2.3倍。原代FLSs经LPS刺激后，PLCn2 mRNA表达下降71%，提示炎症微环境可能抑制其表达。

PLCn2通过HRAS-RAF1互作调控多条信号通路
BiFC和co-IP实验证实PLCn2_C2直接结合HRAS，破坏其与RAF1的结合（结合率降低62%）。磷酸化蛋白芯片显示，PLCn2过表达使NF-κB p65、STAT3和ERK1/2的磷酸化水平分别下降45%、38%和52%。

动物实验验证治疗潜力
在CIA模型中，关节腔注射Ad-PLCn2_C2使临床评分降低64%，组织学显示滑膜增生和骨侵蚀显著改善。qPCR检测关节组织中炎性细胞因子表达量下降55%-72%。

结论与意义
该研究首次揭示PLCn2通过其C2结构域以Ca²⁺非依赖方式发挥RA抑制作用，其分子机制是通过竞争性结合HRAS，阻断下游RAF1-MAPK/ERK、JAK-STAT和NF-κB三条关键炎症通路的激活。这一发现具有双重价值：在理论层面，阐明了C2结构域蛋白调控RA的新范式；在转化医学层面，PLCn2_C2可作为靶向FLSs的精准治疗模块，避免全身免疫抑制带来的感染风险。研究采用的"功能域组学"筛选策略也为其他复杂疾病的靶点发现提供了方法论参考。论文发表于《Experimental & Molecular Medicine》，为开发基于蛋白质相互作用的新型RA疗法奠定了重要基础。