软 X 射线断层扫描技术揭示 tasA 基因缺失对枯草芽孢杆菌生物膜结构的影响
在微生物学研究领域,德国海德堡大学有机体研究中心(Centre for Organismal Studies, Heidelberg University)的研究人员 Anthoula Chatzimpinou 等人取得了一项重要进展。他们的研究成果以 “Soft X-ray tomography reveals variations in B. subtilis biofilm structure upon tasA deletion” 为题,发表于npj Biofilms and Microbiomes期刊。该研究利用软 X 射线断层扫描技术(soft X-ray tomography,SXT),深入探究了 tasA 基因缺失对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物膜结构的影响,为理解生物膜形成机制提供了新的视角,在生物膜相关研究领域具有重要意义。
一、研究背景
生物膜是微生物在自然环境中普遍存在的一种生存形式,由微生物细胞及其分泌的胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成。生物膜在众多领域,如医学、环境科学、工业等都发挥着关键作用。在医学方面,生物膜的存在与许多慢性感染性疾病密切相关,细菌形成的生物膜能够增强其对宿主免疫系统和抗生素的抵抗力,导致感染难以治愈 。在环境科学领域,生物膜参与了水体净化、土壤养分循环等重要生态过程 。在工业中,生物膜可能会引起管道腐蚀、设备污染等问题 。
枯草芽孢杆菌作为研究生物膜形成的模式生物,其生物膜的胞外基质包含多糖和主要蛋白质成分 TasA 等物质。TasA 能够形成丝状和纤维状结构,在生物膜的构建、保护细胞免受氧化应激、促进细胞与细胞膜的相互作用以及作为发育信号刺激部分生物膜细胞恢复运动表型等方面发挥着重要作用 。然而,由于生物膜具有高度的异质性且含水量高,传统的三维成像技术在分析生物膜结构时面临诸多挑战,如样品固定、干燥、冷冻和脱水等处理步骤可能会破坏生物膜的形态和三维结构,从而影响对其真实结构的观察和分析 。因此,开发一种能够在生理状态下对生物膜进行高分辨率三维成像的技术至关重要。
二、研究材料与方法
(一)实验菌株
研究使用的野生型和 ΔtasA 枯草芽孢杆菌菌株均源自 B. subtilis DK1042 菌株,该菌株基于含有 pBS32 的野生型(祖先 3610 菌株),编码一种在密码子 125 处发生 Q-to-L 变化的 ComI 变体 。为了便于观察,通过 PCR 扩增将 gfp 基因整合到 amyE 位点,并在 Phyperspank 的控制下进行表达,构建了相应的重组菌株。实验中使用的菌株信息及相关引物序列在论文的表格中详细列出。
(二)培养条件
细菌培养从冷冻保存的菌种开始,在含有 1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物和 1% NaCl 的 Luria-Bertani(LB)培养基中,于 30°C 培养。接种后,细菌在 LB 培养基中于 30°C、160 rpm 振荡培养过夜。在进行生物膜实验前,将细菌以 1:100 的浓度转接至新鲜培养基中,培养至光密度(OD)达到 1.0 - 1.2,约需 4 - 5 小时 。生物膜的形成通过在 “Medium optimal for lipopeptide production”(MOLP)培养基中培养细菌来促进,该培养基的成分包括 30 g/L 蛋白胨、20 g/L 蔗糖、7 g/L 酵母提取物等多种物质,pH 调整为 7.0,在 30°C 培养 22 - 44 小时 。此外,为了筛选阳性克隆,在培养基中添加了相应的抗生素,野生型菌株使用 150 μg/mL 壮观霉素,ΔtasA 菌株使用 10 μg/mL 卡那霉素 。
(三)关键技术路线
- “生物膜 - 毛细管” 生长方法:为了实现对生物膜的高分辨率三维成像,研究人员开发了一种 “生物膜 - 毛细管” 生长方法。首先,将细菌在 MOLP 培养基中培养至合适的细胞密度,然后将其接种到 6 孔板中,在 30°C 静置培养 2 小时。之后,取 20 μL 稀释后的细菌悬液注入特制的薄壁玻璃毛细管中,毛细管尖端直径为 9 - 10 μm。将毛细管放置在 6 孔板中,通过中间包裹有消毒 parafilm 的腔壁支撑,并使用间隔物保持毛细管尖端与板盖之间的安全距离 。最后,将 6 孔板用湿毛巾包裹放入密封塑料袋中,在 30°C 培养 22 - 44 小时,使细菌在毛细管尖端形成生物膜 。
- 软 X 射线断层扫描(SXT)成像:对于形成生物膜的毛细管,使用液态丙烷在液氮冷却下(约 -90°C)进行快速冷冻,以固定生物膜的结构。随后,利用位于美国劳伦斯伯克利国家实验室先进光源的软 X 射线显微镜 XM - 2 进行全旋转成像 。在数据采集过程中,为了防止辐射损伤,细胞暴露在液氮冷却的氦气流中 。每个数据集通过收集 184° 旋转断层图像获得,每 2° 采集一张投影图像 。采集到的投影图像经过自动重建软件处理,重建成三维体积数据,再通过分割和三维渲染,实现对细菌和生物膜的三维可视化 。
- 图像分析与统计方法:利用开源软件 Fiji 对生物膜的光学显微镜图像进行分析 。对于重建后的 SXT 数据集,使用 DragonFly 软件支持的 2.5D UNet 模型对单个细菌进行自动分割,而 ECM 则通过 Amira 2020.3.1 软件基于像素强度阈值进行手动分割 。使用 Amira 软件对分割后的单个细菌、ECM 和毛细管壁进行三维渲染 。在统计分析方面,使用 Jupyter notebook 和 statannot 包进行统计检验(Student’s t - 检验),并添加统计注释,最终使用 Inkscape 1.3 软件组装 figures。
三、研究结果
(一)“生物膜 - 毛细管” 工作流程的建立与验证
研究人员成功开发了适用于枯草芽孢杆菌的 “生物膜 - 毛细管” 工作流程。通过光学显微镜观察,包括对表达 GFP 的枯草芽孢杆菌 BKD211 进行体内成像,发现细菌能够在毛细管尖端迁移并形成生物膜,且生物膜在平板孔表面也呈现出特征性的褶皱图案 。利用软 X 射线显微镜对冷冻保存的生物膜进行成像,并通过 2.5D U - Net 模型对重建体积进行自动分割,能够在单细胞水平和总体形态上对生物膜结构进行分析。这表明该工作流程能够实现需氧细菌细胞生物膜的生长,并与 SXT 的高分辨率三维成像兼容。
(二)TasA 基因缺失导致细胞取向和 ECM 压实的丧失
应用建立的工作流程对野生型枯草芽孢杆菌生物膜进行研究。通过采集多个视野(FOVs)来测量毛细管长度上的结构变化,由于从开口端开始毛细管直径会发生变化,因此通过逐渐降低显微镜放大倍数来补偿视野大小的变化 。在 22 小时的生物膜中,观察到细菌在某些视野(如 FOVs 1、2、3、4 和 8)中紧密排列成簇,且在部分视野(如 FOVs 3、5、7 和 9)中存在链式排列,这是生物膜早期阶段的特征 。同时,ECM 的分布比细菌密集聚集区域更为分散 。
相比之下,对于 tasA 基因缺失的 ΔtasA 枯草芽孢杆菌生物膜,细胞不再呈现有序的链式排列,而是随机取向。通过对单个细菌细胞的体积、形状(通过纵横比测量)和密度进行定量分析,发现枯草芽孢杆菌细胞的平均体积约为
,不受 tasA 基因缺失的影响 。然而,在生物膜形成过程中,与悬浮培养的细胞相比,细胞的伸长程度降低,野生型和 ΔtasA 菌株的纵横比均有所增加 。此外,野生型细胞在生物膜形成过程中,X 射线吸收略有增加,表明分子密度增加,而 ΔtasA 菌株则无显著差异 。在 ECM 方面,tasA 基因的缺失导致 ECM 片段的化学密度增加,这可能是由于突变细胞中细胞应激或活性氧(ROS)产生增加,导致胞外多糖(EPS)分泌升高 。对细胞取向的分析表明,野生型生物膜中的细胞在毛细管尖端的某些区域具有相同的取向,有时会形成螺旋几何结构,而 ΔtasA 菌株的生物膜中所有视野均缺乏有序的细胞取向 。
(三)补充 TasA 蛋白恢复生物膜形态
先前研究表明,向 ΔtasA 细菌培养物中添加 TasA 蛋白可恢复生物膜 。本研究应用 “生物膜 - 毛细管” 工作流程对添加 TasA 蛋白 44 小时后的生物膜进行研究。结果显示,添加 TasA 蛋白后,ΔtasA 培养物形成的生物膜在形态上与野生型枯草芽孢杆菌生物膜相似,但不如野生型明显 。从定量分析来看,添加 TasA 蛋白后,ΔtasA 细胞的形状发生显著变化,变得更加球形,纵横比从 0.19 ± 0.01 增加到 0.24 ± 0.08 。细胞的生化密度显著降低,且大多数细胞中出现了具有高 LAC 值(
)的致密球形结构 “punctae”,推测其可能含有大量脂质 。在 ECM 方面,添加 TasA 蛋白后,ECM 密度与未处理的 ΔtasA 细胞相比无显著差异,但 ECM 体积相对于细菌细胞数量恢复了 13% 。这表明添加细胞外 TasA 蛋白可部分恢复 ECM 的组成,但不能恢复生物膜中细菌细胞的有序结构和表型 。
四、研究结论与讨论
本研究通过开发 “生物膜 - 毛细管” 工作流程,并结合软 X 射线断层扫描技术,在生理状态下对枯草芽孢杆菌生物膜进行了亚细胞和宏观尺度的分析。研究结果表明,tasA 基因的缺失显著影响了生物膜的结构和细胞表型。在细胞水平上,导致细胞伸长和化学密度发生变化;在宏观水平上,使细胞取向丧失 。而向 ΔtasA 培养物中添加 TasA 蛋白虽然能够部分恢复 ECM 的生化密度和体积,但无法完全恢复细胞的组织和表型,这暗示了 TasA 在生物膜形成过程中对细胞代谢和运动具有复杂的作用 。
此外,基于 SXT 的高空间分辨率和对化学密度的敏感性,研究人员还发现了在添加 TasA 蛋白后,ΔtasA 细胞内存在脂质积累的现象 。该研究不仅为理解 TasA 在枯草芽孢杆菌生物膜形成中的作用提供了重要依据,也展示了 “生物膜 - 毛细管” 工作流程结合 SXT 技术在生物膜研究中的强大功能 。未来,该方法有望应用于其他类型的生物膜研究,包括多物种生物膜以及生物膜与人工添加剂(如纳米颗粒)相互作用的研究 。同时,通过与相关荧光显微镜技术的结合,实现对特定蛋白质的定位,将进一步深入揭示生物膜形成的机制和微环境的影响 。总之,这项研究为生物膜领域的研究开辟了新的途径,具有重要的理论和实践意义。