《Cell Death Discovery》：Pan-caspase inhibitors induce secretion of HIV-1 latency reversal agent lymphotoxin-alpha from cytokine-primed NK cells
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HIV-1 潜伏库是治愈 HIV-1 的重大障碍，“休克并杀死” 策略效果不佳。研究人员开展了泛半胱天冬酶抑制剂对 NK 细胞影响的研究，发现其可诱导 NK 细胞分泌淋巴毒素 -α（LTα）激活潜伏 HIV-1，且不影响 NK 细胞杀伤能力，为 HIV-1 治愈研究提供新策略。
在攻克 HIV-1 感染的漫长征程中，一个巨大的阻碍横亘在科学家面前 ——HIV-1 潜伏库。这些潜伏在 CD4
+ T 细胞中的病毒，就像隐藏在黑暗中的 “定时炸弹”。即便抗逆转录病毒疗法（ART）能成功抑制病毒复制，让患者血液中的病毒载量降至检测不到的水平，可一旦 ART 中断，病毒就会迅速 “卷土重来”，导致病情复发。
“休克并杀死” 策略曾被寄予厚望，它试图利用潜伏逆转剂（LRAs）激活潜伏的 HIV-1，再借助细胞毒性淋巴细胞将被激活的病毒感染细胞清除。但现实却很残酷，LRAs 在体内的疗效不佳，还会产生脱靶效应，使得这一策略难以达到预期效果。在这样的困境下，自然杀伤（NK）细胞凭借独特优势进入了研究人员的视野。NK 细胞无需依赖抗原特异性识别，就能介导细胞毒性，这为增强 “休克并杀死” 策略提供了新方向。此前研究发现，泛半胱天冬酶抑制剂可诱导 NK 细胞分泌一种未知的 LRA，然而这种 LRA 究竟是什么，一直是个未解之谜。
来自瑞典卡罗林斯卡学院（Karolinska Institutet）的研究人员决心解开这个谜题。他们开展了一系列研究，最终发现淋巴毒素 -α（LTα）就是经泛半胱天冬酶抑制剂处理后，NK 细胞分泌的关键 LRA。这一发现意义重大，为 HIV-1 治愈研究开辟了新的道路。相关研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞培养方面，培养了多种细胞系用于实验。通过靶向蛋白质组学技术中的邻近延伸分析（PEA）平台，筛选 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后分泌的蛋白质。利用荧光素酶报告基因实验检测 LRA 活性，判断细胞培养上清液能否诱导 HIV-1 长末端重复序列（LTR）启动子活性。借助 NK 细胞杀伤实验评估 NK 细胞的细胞毒性。研究样本来自匿名献血者的外周血单个核细胞（PBMCs）。
泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞分泌组变化
研究人员将 NK 淋巴瘤细胞系 KHYG-1 与泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK 或 emricasan 共同孵育，在 4 小时和 12 小时后收集上清液。同时设置对照组，包括经强激活剂佛波酯（PMA）和离子霉素（PMAi）刺激的 NK 细胞，以及用针对 NK 细胞激活受体 NKp30 的激动剂抗体刺激的 NK 细胞。首先用荧光素酶报告基因实验验证上清液中是否存在 LRA 活性，结果显示，经泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞和 NKp30 激活的 NK 细胞的上清液，LRA 活性在 4 小时到 12 小时之间有所增加。随后，使用 PEA 平台分析 733 种蛋白质的相对水平，发现处理 4 小时时，只有 11 种蛋白质水平有统计学差异；处理 12 小时后，有 35 种蛋白质水平出现差异，其中包括之前报道过的由泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞分泌的 CCL3、CCL4 和 IL-10 等，还有 LTα、M-CSF/CSF1、IL-8/CXCL8 和 TNF 等细胞因子水平也有所上升。
淋巴毒素 -α 是 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后上清液中 LRA 活性的关键因素
在已鉴定的分泌蛋白中，TNF 和 LTα 都已知能诱导 HIV-1 重新激活。由于 PEA 实验无法提供蛋白质的绝对定量，研究人员进一步探究这两种细胞因子中哪种是 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后上清液中 LRA 活性的来源。在荧光素酶实验模型中，TNF 激活 HIV-1 启动子的浓度比 LTα 低 10 倍以上。接着分析中和这两种细胞因子的 LRA 诱导活性所需的最佳抗体浓度，发现中和 LTα 需要高浓度的 LTα 中和抗体（nAb）。最后，用 nAb 预处理 KHYG-1 细胞上清液后测量 LRA 活性，结果表明 TNF nAb 无法抑制 Z-VAD-FMK 处理的 KHYG-1 上清液的 LRA 活性，而 LTα nAb 可完全消除其 LRA 活性，同型对照抗体则无此效果，这充分证明是 LTα 诱导了 HIV-1 重新激活。
细胞因子预刺激人原代 NK 细胞是 Z-VAD-FMK 诱导 LRA 活性的必要条件
研究人员此前发现 Z-VAD-FMK 可诱导经 IL-21 和高剂量 IL-2 预刺激的人原代 NK 细胞产生 LRA 活性。此次研究进一步验证细胞因子预刺激对 Z-VAD-FMK 发挥间接 LRA 效应的必要性。将富集的人原代 NK 细胞在无细胞因子（静息 NK 细胞）或低剂量 IL-2 条件下培养，Z-VAD-FMK 无法诱导 LRA 活性。但当低剂量 IL-2 与 IL-12、IL-15、IL-18 或 IL-21 联合使用时，Z-VAD-FMK 处理后的人原代 NK 细胞上清液中 LRA 活性增加，尤其是 IL-2/IL-12 和 IL-2/IL-18 细胞因子组合。并且，LTα nAb 可消除 IL-2/IL-12 预刺激的 Z-VAD-FMK 处理的人原代 NK 细胞上清液中的 LRA 活性，这表明 NK 细胞需要细胞因子诱导的信号来分泌 LTα，进而发挥 HIV-1 潜伏逆转作用。
泛半胱天冬酶抑制剂处理不影响细胞因子预刺激的人原代 NK 细胞的细胞毒性
在 “休克并杀死” 策略中，泛半胱天冬酶抑制剂不能影响 NK 细胞的细胞毒性。研究人员将 IL-2/IL-12 预刺激的人原代 NK 细胞与 Z-VAD-FMK 预孵育，然后与 J-Lat 细胞以不同的效应细胞与靶细胞比例（E:T）共培养 4 小时，通过流式细胞术分析发现，与对照 NK 细胞相比，Z-VAD-FMK 处理的 NK 细胞介导的靶细胞死亡百分比并未降低，在 1:1 的 E:T 比例下，细胞毒性甚至略有增加，这说明泛半胱天冬酶抑制剂在细胞因子预刺激的人原代 NK 细胞中，可通过释放 LTα 介导 HIV-1 重新激活，且不影响 NK 细胞的细胞毒性。
综合研究结果，研究人员得出结论：细胞因子预刺激的 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后，可通过分泌 LTα 有效激活潜伏的 HIV-1，同时不损害 NK 细胞的细胞毒性。这一发现为 HIV-1 治愈研究中的 “休克并杀死” 策略提供了潜在的增强方法。
在讨论部分，研究人员指出，基于 NK 细胞的疗法在 HIV-1 感染功能性治愈研究中具有广阔前景。泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞细胞因子释放有限，可能会减少体内治疗时的并发症，如细胞因子释放综合征。虽然泛半胱天冬酶抑制剂可能对淋巴细胞中的半胱天冬酶功能产生影响，但在细胞因子预刺激的 NK 细胞中，其能发挥积极作用。此外，将细胞因子治疗与泛半胱天冬酶抑制剂治疗相结合，有望增强 NK 细胞功能，与其他 LRAs 联合使用，还可能克服药物毒性和疗效低等治疗障碍。未来，开发更具特异性的药物，精准调节 NK 细胞活性，同时避免阻断细胞凋亡信号通路，将是研究的重要方向。这项研究为 HIV-1 治愈研究提供了新的思路和潜在的治疗靶点，推动了该领域的发展，让人们在攻克 HIV-1 感染的道路上又前进了一步 。
