自然杀伤细胞新发现:为 HIV 治愈研究带来曙光
在攻克 HIV 感染这一全球性难题的征程中,科研人员从未停止探索的脚步。来自瑞典卡罗林斯卡学院(Karolinska Institutet)传染病学系 ANA Futura 实验室的研究人员 Zamaneh Hajikhezri、Ioannis Zygouras、Anders S?nnerborg 和 Robert van Domselaar,在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “Pan-caspase inhibitors induce secretion of HIV-1 latency reversal agent lymphotoxin-alpha from cytokine-primed NK cells” 的论文。这一研究成果为 HIV 治愈研究提供了全新的思路和潜在策略,有望推动 “休克 - 杀伤” 疗法取得实质性进展,在 HIV 研究领域具有重要意义。
一、研究背景
HIV-1 感染后,在记忆 CD4 T 细胞中形成的潜伏库是实现功能性治愈的主要障碍。尽管抗逆转录病毒疗法(ART)能有效抑制病毒复制,使患者血浆病毒载量检测不到,阻止疾病进展,但一旦停药,病毒就会从潜伏库中重新激活,导致病毒血症复发。“休克 - 杀伤” 策略是目前极具潜力的清除潜伏库的方法,即利用潜伏逆转剂(LRAs)激活潜伏感染细胞中的 HIV-1,再通过细胞毒性淋巴细胞(如 HIV-1 特异性 CD8 T 细胞和自然杀伤细胞 NK)将其清除。然而,现有的 LRAs 因疗效低和脱靶效应,无法有效减少体内病毒库。
NK 细胞凭借其无需依赖抗原特异性即可介导细胞毒性的能力,在细胞免疫疗法中崭露头角,为增强 “休克 - 杀伤” 策略提供了新途径。此前研究发现,人类外周血 NK 细胞与 LRA 联合,可在人源化小鼠模型中延迟 ART 中断后 HIV-1 的反弹并减少潜伏库;还有研究表明,激活的 NK 细胞与双特异性抗体协同,能增强对 HIV-1 感染细胞的杀伤作用,进一步降低潜伏库。研究团队前期也证实,泛半胱天冬酶抑制剂可调节 NK 细胞活性,促使其释放一种未知的 LRA,且这种 LRA 与其他 LRAs 具有协同作用。在此基础上,该研究旨在明确这种未知 LRA 的具体成分,深入探究其作用机制。
二、研究材料与方法
(一)细胞培养
实验涉及多种细胞,TZM-bl 细胞用含 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、20 U/mL 青霉素和 20 μg/mL 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM)培养;KHYG - 1 细胞在添加 10% FBS、25 mM HEPES、20 U/mL 青霉素、20 μg/mL 链霉素和 100 U/mL 重组人白细胞介素 - 2(IL - 2)的罗斯威尔公园纪念研究所 1640 培养基(RPMI)中培养;J - Lat 10.6 细胞的培养则是在 RPMI 培养基中加入相同的补充成分。所有细胞均在 5% CO?、37°C 的条件下培养。
(二)富集原代 NK 细胞
从匿名献血者的血沉棕黄层中,利用 Ficoll 密度离心法和 SepMate? - 50 管分离外周血单个核细胞(PBMCs),将其冻存于液氮。使用时解冻,在含 5% 人 AB 血清的 AIM - V 培养基中过夜培养,次日通过 EasySep?人 NK 细胞富集试剂盒阴性选择法获取原代 NK 细胞,将其置于含 5% 人 AB 血清和特定细胞因子的 AIM - V 培养基中备用。
(三)试剂与抗体
实验使用的泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK 和 emricasan 分别购自 Enzo Life Sciences 和 Selleckchem;重组人 IL - 12 p70、IL - 15、IL - 21、TNF 和 LTα 购自 PeproTech,重组人 IL - 18 购自 ThermoFisher Scientific;多种中和抗体和激动剂抗体购自 Cell Signaling Technologies 和 R&D Systems 等公司;其他试剂如 Prostratin、PMA、ionomycin 等购自 Sigma;细胞增殖和死细胞染色试剂盒购自 ThermoFisher Scientific。
(四)研究技术路线
- 蛋白质组学分析:将 KHYG - 1 细胞(1×10?/mL)接种于含 100 U/mL IL - 2 的完全 RPMI 培养基中,分别用 0.5% DMSO、50 μM Z - VAD - FMK、50 μM emricasan、1 μg/mL NKp30 激动剂抗体、10 ng/mL PMA 和 1 μg/mL ionomycin 处理,4 h 和 12 h 后收集上清,部分用于荧光素酶检测验证 LRA 活性,其余用于蛋白质组学分析。利用 PEA 平台检测 733 种蛋白质的相对丰度,通过在线 Olink 统计分析应用程序进行 ANOVA F 检验、事后分析和热图生成,手动绘制维恩图。
- 荧光素酶检测:实验前一天将 TZM - bl 细胞(2×10? cells)接种于 96 孔板。NK 细胞与 Z - VAD - FMK(50 μM)或 DMSO(0.5%)孵育过夜后收集上清,加入 TZM - bl 细胞中,同时设置多种对照。若进行 TNF 和 LTα 中和实验,需先将 NK 细胞上清与相应中和抗体或同型对照在 37°C 孵育 2 h。培养一天后,裂解细胞,加入荧光素酶试剂,在酶标仪上测量发光强度,计算相对发光单位(RLU)的倍数变化。
- NK 细胞杀伤实验:实验前一天用 2 μM CellTrace Violet 染料标记 J - Lat 10.6 细胞。原代 NK 细胞与 IL - 2(50 U/mL)和 IL - 12(50 ng/mL)培养 24 h,再与 Z - VAD - FMK(50 μM)或 DMSO(0.5%)孵育 1 h,洗涤后按不同效应细胞与靶细胞比例(E:T)加入 J - Lat 细胞。共培养 4 h 后,收集细胞,进行近红外活力染料染色、固定等处理,最后用流式细胞仪检测 NK 细胞对靶细胞的杀伤百分比。
三、研究结果
(一)泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞分泌组变化
研究人员采用靶向蛋白质组学方法筛选 NK 细胞在泛半胱天冬酶抑制剂处理后分泌的蛋白。通过荧光素酶检测发现,泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞和 NKp30 激活的 NK 细胞上清液在 4 - 12 h 内 LRA 活性增强,而 PMA 和 ionomycin(PMAi)处理的 NK 细胞上清液因自身激活报告细胞的 LTR 启动子活性,无法在该系统中准确评估 LRA 活性。
蛋白质组学分析显示,处理 4 h 时,与对照组相比,泛半胱天冬酶抑制剂处理的细胞分泌组仅有 11 种蛋白质水平存在统计学差异;处理 12 h 后,差异蛋白质增加到 35 种,包括 CCL3、CCL4、IL - 10 等已知由泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞分泌的蛋白,以及 LTα、M - CSF/CSF1、IL - 8/CXCL8 和 TNF 等细胞因子。
(二)淋巴毒素 - α(LTα)是 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后上清液中 LRA 活性的关键因素
在已鉴定的分泌蛋白中,TNF 和 LTα 都可能诱导 HIV - 1 重新激活。荧光素酶实验表明,TNF 激活 HIV - 1 启动子的浓度比 LTα 低 10 倍以上。进一步研究发现,中和 LTα 需要高浓度的 LTα 中和抗体(nAb),而 TNF nAb 无法抑制 Z - VAD - FMK 处理的 KHYG - 1 上清液的 LRA 活性,LTα nAb 则可完全消除该活性,同型对照抗体无此效果,这充分表明 LTα 是诱导 HIV - 1 重新激活的关键物质。
(三)细胞因子预刺激人原代 NK 细胞是 Z - VAD - FMK 诱导 LRA 活性的必要条件
前期研究显示 Z - VAD - FMK 可诱导经 IL - 21 和高剂量 IL - 2 预刺激的人原代 NK 细胞产生 LRA 活性。此次研究发现,在无细胞因子或低剂量 IL - 2 培养条件下,Z - VAD - FMK 无法诱导静息 NK 细胞产生 LRA 活性;而当低剂量 IL - 2 与 IL - 12、IL - 15、IL - 18 或 IL - 21 联合使用时,Z - VAD - FMK 处理的人原代 NK 细胞上清液中可检测到增强的 LRA 活性,尤其是 IL - 2/IL - 12 和 IL - 2/IL - 18 细胞因子组合效果显著。并且,LTα nAb 可消除 IL - 2/IL - 12 预刺激的 Z - VAD - FMK 处理的人原代 NK 细胞上清液的 LRA 活性,这表明 NK 细胞需要细胞因子诱导的信号来分泌 LTα,从而发挥 HIV - 1 潜伏逆转作用。
在评估泛半胱天冬酶抑制剂对 NK 细胞细胞毒性的影响时,将 IL - 2/IL - 12 预刺激的人原代 NK 细胞与 Z - VAD - FMK 预孵育,再与 J - Lat 细胞共培养,通过流式细胞术分析发现,与对照 NK 细胞相比,Z - VAD - FMK 处理的 NK 细胞在各效应细胞与靶细胞比例下,对靶细胞的杀伤百分比未降低,在 1:1 的 E:T 比例下,细胞毒性甚至略有增加,这说明泛半胱天冬酶抑制不会损害细胞因子预刺激的人原代 NK 细胞的细胞毒性。
四、研究结论与讨论
(一)研究结论
该研究成功鉴定出 LTα 是 NK 细胞经泛半胱天冬酶抑制剂处理后分泌的关键 HIV - 1 潜伏逆转剂。细胞因子预刺激是 NK 细胞在泛半胱天冬酶抑制剂处理后分泌 LTα 的必要条件,且这种处理不会影响 NK 细胞的细胞毒性。这意味着细胞因子预刺激的 NK 细胞在泛半胱天冬酶抑制剂作用下,可通过分泌 LTα 有效激活潜伏的 HIV - 1,同时保留杀伤被激活病毒感染细胞的能力。
(二)讨论
NK 细胞在 HIV - 1 感染治疗中的应用前景广阔,其非特异性识别危险和应激信号的能力为治疗策略提供了新方向。泛半胱天冬酶抑制剂处理 NK 细胞后,虽然细胞因子释放有限,但能精准筛选出具有生物学意义的关键因子 LTα。尽管 LTα 诱导 HIV - 1 重新激活的能力比 TNF 弱,但因其可分泌为可溶性同型三聚体,能非特异性地作用于众多细胞,使 HIV - 1 潜伏感染细胞重新激活,随后 NK 细胞可通过细胞间接触特异性杀伤这些细胞。
从临床应用角度看,泛半胱天冬酶抑制剂处理的 NK 细胞细胞因子释放有限,有望减少体内治疗时如细胞因子释放综合征等并发症的发生。且 emricasan 等泛半胱天冬酶抑制剂已在其他临床试验中显示出安全性和耐受性,为其在 HIV 治疗中的应用提供了一定的可行性基础。同时,细胞因子处理和泛半胱天冬酶抑制剂处理联合使用,可增强 NK 细胞对抑制剂的敏感性,提升其杀伤能力,与其他 LRAs 联合使用,还可能克服药物毒性和疗效低的问题。
然而,研究也存在一些局限性。泛半胱天冬酶抑制剂对其他免疫细胞的影响尚未明确,且半胱天冬酶在淋巴细胞中可能具有未被充分认识的非经典作用,如阻断 T 细胞中 TCR 介导的 NF - κB 信号通路影响 HIV - 1 重新激活,抑制 NK 细胞中 IL - 2 诱导的增殖和细胞因子释放等。未来需要深入研究半胱天冬酶在 NK 细胞激活信号通路中的作用机制,开发更具特异性的药物,在不影响 NK 细胞杀伤 HIV - 1 重新激活细胞能力的前提下,精准调节 NK 细胞活性。
总体而言,该研究为 HIV 治愈研究提供了重要的理论依据和潜在治疗策略。通过进一步优化和探索,以 NK 细胞为基础,结合泛半胱天冬酶抑制剂和细胞因子的治疗方案,有望在攻克 HIV 感染难题上取得重大突破,为实现 HIV 功能性治愈带来新的希望。