βIV谱蛋白丰度、细胞分布及对AKT/GSK3调控的敏感性

　　

探索精神分裂症潜在生物标志物：βIV 血影蛋白与 AKT/GSK3 通路的关联研究

美国德克萨斯大学医学分校加尔维斯顿分校药理学与毒理学系的研究人员 Jessica Di Re 等人在《Molecular Psychiatry》期刊上发表了题为 “βIV spectrin abundancy, cellular distribution and sensitivity to AKT/GSK3 regulation in schizophrenia” 的论文。该研究对于深入理解精神分裂症（SCZ）的发病机制、寻找可靠的生物标志物以及开发新的治疗方法具有重要意义。

研究背景

精神分裂症是一种严重的精神疾病，影响近 1% 的人口，具有较高的遗传度，但遗传和环境因素相互作用影响其临床表现的潜在机制仍不清楚。尽管全基因组关联研究和转录组分析揭示了一些与疾病风险相关的基因表达变化和遗传变异，但细胞层面上脆弱基因枢纽与疾病分子内表型之间的联系尚不明确。

血影蛋白是一类细胞骨架蛋白，在神经元细胞结构调节中发挥关键作用。βIV 血影蛋白直接与电压门控钠离子通道相互作用，控制其在轴突起始段（AIS）的定位，调节神经元放电。此前研究表明，AKT/GSK3 信号通路参与调节 βIV 血影蛋白在原代海马神经元中的分布，且该通路与精神分裂症密切相关。基于此，研究人员推测 βIV 血影蛋白在精神分裂症中可能存在异常，并且是 AKT/GSK3 通路的作用靶点，其对该通路的敏感性也可能发生改变。

研究材料和方法

1. 诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元制备：使用来自哥斯达黎加中央山谷（CVCR）精神分裂症多重家庭的 iPSC 诱导神经元细胞系，以及来自加州再生医学研究所（CIRM）生物样本库的健康对照细胞系和携带 16p11.2 染色体区域微重复的精神分裂症患者细胞系。

2. 细胞培养：详细描述了不同细胞系的培养过程，包括将人淋巴母细胞系重编程为 hiPSCs、神经元前体细胞分化和皮质神经元分化等步骤，以及培养过程中使用的培养基和添加物。

3. 抑制剂处理：在体外培养第 21 天（DIV 21），用 GSK3 抑制剂 CHIR99021、AKT 抑制剂 triciribine 或 0.5% DMSO 作为对照处理神经元，24 小时后固定细胞用于成像。

4. 免疫细胞化学和免疫组织化学：使用针对 βIV 血影蛋白、MAP2 等的特异性抗体进行染色，以检测蛋白质表达和定位。免疫组织化学样本来自美国国立精神卫生研究所人脑收集核心（HBCC）的死后背外侧前额叶皮层（DLPFC）样本。

5. 图像采集和分析：使用共聚焦显微镜采集图像，用 ImageJ 或 Fiji 软件分析荧光强度。通过在感兴趣区域（ROI）进行强度测量，分析 βIV 血影蛋白在不同细胞部位的表达水平。

6. 机器学习分析：对 AIS 和神经突的荧光强度信号进行离散傅里叶变换（DFT），选择 DFT 系数作为特征，使用随机森林分类器预测治疗组或疾病状态。对胞体分析则使用 py - Radiomics 工具箱生成统计矩阵，训练随机森林分类器进行预测。

7. 转录组数据分析：从 PsychENCODE 知识门户下载死后人类 DLPFC 的 RNA - seq 数据，使用 limma/voom 和替代变量分析（SVA）进行差异基因表达分析，控制脑库、性别、年龄等混杂因素。

8. 肽预测和激酶活性测定：使用计算平台预测 AKT/GSK3 在 βIV 血影蛋白上的磷酸化位点，通过体外激酶活性测定验证预测的磷酸化位点。

9. 统计分析：使用 QQ 图评估数据正态性，对不同条件下的神经突和胞体平均荧光强度进行双向混合模型 ANOVA 分析，使用 Dunnett 或 Sidak 多重比较检验或嵌套 t 检验确定组间差异。

研究技术路线

研究人员首先获取死后脑组织样本和 iPSC 来源的神经元，对其进行处理和染色，获取图像数据。通过生物信息学分析转录组数据，预测磷酸化位点。利用机器学习算法对图像数据和其他特征进行分析，构建分类模型，评估 βIV 血影蛋白相关特征在区分精神分裂症患者和健康对照中的能力。

研究结果

1. βIV 血影蛋白在 SCZ 患者 DLPFC 中下调：研究人员从 NIMH HBCC 获取新鲜冷冻的 DLPFC 组织样本，选取 15 例健康对照（HC）和 12 例 SCZ 患者样本进行免疫组织化学分析。结果显示，HC 样本中 βIV 血影蛋白在神经元中有独特分布模式，在胞质中存在核周积累且在 AIS 富集。而 SCZ 患者 AIS 处 βIV 血影蛋白荧光强度显著降低，AIS / 胞体比值也显著减小，神经元胞体中分布模式更紊乱。使用随机森林分类器，基于 AIS 和胞体的 βIV 血影蛋白强度特征能准确预测疾病类别，AIS 处分类准确率达 98.6% ± 1.1%。

2. βIV 血影蛋白 mRNA 在 SCZ 中上调：利用 PsychEncode 数据集（包含 802 例 HC 和 563 例 SCZ 病例的 mRNA 测序数据），校正混杂因素后分析发现，SCZ 患者中 SPTBN4（编码 βIV 血影蛋白的基因）显著上调，与 DLPFC 中 βIV 血影蛋白蛋白质水平下降呈负相关。同时，AKT2 在 SCZ 中增加，AKT3 减少，SPTBN4 表达与 AKT2 相关，而 GSK3A 和 GSK3B 无显著变化。

3. βIV 血影蛋白上 AKT/GSK3 磷酸化位点的预测：使用计算平台预测 βIV 血影蛋白上的 AKT/GSK3 磷酸化位点，发现 4 个潜在的 GSK3 磷酸化位点和 1 个潜在的 AKT 磷酸化位点。通过基于序列的激酶预测和 AlphaFold 结构建模，排除部分位点后，选择 S45 和 S2543 进行实验验证。体外磷酸化实验表明，GSK3β 能有效磷酸化包含 S45 和 S2543 的 βIV 血影蛋白肽段，且该反应能被 CHIR99021 显著抑制。

4. SCZ 神经元中 βIV 血影蛋白蛋白水平的 AKT/GSK3 调节改变：使用来自两个不同组（CVCR 家庭和 16p11.2 微重复患者）的 iPSC 来源神经元，在基础条件和 AKT/GSK3 通路抑制剂处理下评估 βIV 血影蛋白表达模式和敏感性。CVCR 神经元中，AKT 抑制剂处理后 HC 神经元 AIS 处 βIV 血影蛋白染色强度增加，而 SCZ 细胞系无此反应，且 SCZ 细胞在各种处理下 AIS 处 βIV 血影蛋白荧光强度均降低。16p11.2 微重复细胞系中，HC 神经元和 SCZ 神经元对 GSK3 和 AKT 抑制的反应不同，随机森林分类器在区分两组细胞时准确率超过 95%。

研究结论

该研究表明，βIV 血影蛋白在精神分裂症患者死后组织的蛋白质和转录水平均存在异常，且其可能是 AKT/GSK3 通路的靶点，通过 GSK3 对 S45 或 S2543 的磷酸化进行调节。在 iPSC 来源的神经元实验中，发现精神分裂症神经元中 βIV 血影蛋白对 AKT/GSK3 激酶抑制剂的反应减弱，反映出其在调节神经元放电方面的能力受损。随机森林算法分析显示，基于 βIV 血影蛋白成像特征的分类器在区分精神分裂症患者和健康对照时准确率高，可作为可靠的疾病预测指标。

研究讨论

AKT/GSK3 通路与精神分裂症关联已久，但具体机制不明，血影蛋白在精神分裂症中的作用是新的研究方向。此前研究报道过精神分裂症患者中血影蛋白相关转录本的紊乱，本研究进一步证实 βIV 血影蛋白在精神分裂症病理生理中的异常。虽然 mRNA 和蛋白质水平变化方向相反，但均在精神分裂症中改变，体现了同时评估转录和蛋白质变化的重要性。

研究通过计算和实验方法确定了 βIV 血影蛋白上的磷酸化位点，为其与 AKT/GSK3 通路的关联提供了证据。在不同遗传模型的精神分裂症 iPSC 来源神经元实验中，均发现 βIV 血影蛋白表达模式和对 AKT/GSK3 通路调节敏感性的改变，表明 βIV 血影蛋白和 AKT/GSK3 靶点存在汇聚。

随机森林算法评估显示，基于 βIV 血影蛋白成像特征的分类器具有高准确性，可作为精神分裂症的通用分类器。这一发现对于加速复杂精神疾病的药物研发和临床诊断靶点识别具有重要意义，有望为精神分裂症的精准治疗提供新的方向和生物标志物。