新突破！邻近标记技术揭秘金黄色葡萄球菌与内皮细胞的 “互动密码”

本文利用基于抗坏血酸过氧化物酶 2（APEX2）的邻近标记技术，识别出金黄色葡萄球菌（S. aureus）与内皮细胞表面相互作用的 305 种蛋白质，验证了 5 种新的共受体，为揭示细菌内化机制提供关键线索，助力相关疾病研究。

　　

研究背景

病原体感染宿主的过程中，与宿主细胞表面的相互作用极为关键。它们通过多种机制与宿主细胞表面受体结合，进而实现入侵、存活和繁殖。金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为一种机会性兼性细胞内病原体，能引发从软组织、皮肤感染到败血症、中毒性休克等多种疾病。它可入侵上皮细胞、内皮细胞等，其细胞内定位有助于逃避免疫系统攻击和增强对抗生素的抗性。

此前虽已确定了一些金黄色葡萄球菌入侵的受体，但寻找可靠且高效的方法来全面识别宿主 - 病原体相互作用的伙伴仍面临挑战。传统的基因方法（如 RNAi 或 CRISPR 技术）只能筛选出对病原体细胞摄取有显著影响的蛋白质，且基因敲除可能改变细胞表面信号复合物的组成，无法准确确定直接相互作用的伙伴。交联方法虽能更可靠地识别直接相互作用伙伴，但可能遗漏那些在感染过程中起重要作用却不直接与病原体结合的蛋白质。

研究方法

1. 构建 APEX2 修饰的金黄色葡萄球菌：构建了一种融合蛋白，包含 APEX2、黄色荧光蛋白（YFP）和溶葡萄球菌素的细胞壁靶向（CWT）结构域。将该融合蛋白在 HeLa 细胞中胞质表达后，分离出来修饰金黄色葡萄球菌。通过流式细胞术验证了 APEX2 成功附着在金黄色葡萄球菌表面，且修饰后的细菌能在添加过氧化氢（H₂O₂）后，对宿主细胞表面蛋白进行邻近生物素化标记。
2. 细胞培养与处理：培养 HeLa 细胞和人肺微血管内皮细胞（HuLEC），HeLa 细胞在含 GlutaMAX 的 RPMI 1640 培养基中培养，添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 1 mM 丙酮酸钠；HuLEC 在 MCDB131 培养基中培养，添加多种补充成分。实验前按特定时间和方法对细胞进行消化、接种。
3. 制备基因敲除细胞系：基于 CRISPR 技术，使用 CHOPCHOP 在线工具设计针对 PTK7、CD109、MET 等基因的单导向 RNA（sgRNA），克隆到 pSpCas9 (BB)-p2A-GFP 载体中，转化大肠杆菌 DH5α 并测序验证。将构建好的载体转染 HeLa 细胞，经荧光激活细胞分选（FACS）筛选出绿色荧光蛋白（GFP）高表达的细胞，培养后通过蛋白质免疫印迹检测目的基因的表达缺失情况。
4. 金黄色葡萄球菌感染实验：将宿主细胞接种于不同规格的培养板，实验前用杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）清洗，加入感染培养基。若有需要，可在感染前用相应化合物（如阿米替林、离子霉素、β - 毒素等）预处理细胞，或用抗体阻断受体。使用金黄色葡萄球菌 JE2 菌株进行感染，通过离心同步感染，控制感染复数（MOI）。感染一定时间后，用溶葡萄球菌素去除胞外细菌，裂解宿主细胞，通过平板计数法测定胞内细菌数量，计算入侵效率。
5. 邻近标记实验：HuLEC 细胞经预处理后，加入含生物素酚的感染培养基，感染 APEX2 修饰的金黄色葡萄球菌。感染 15 分钟后，清洗细胞，加入含生物素酚的 HBSS 溶液，添加 H₂O₂启动生物素化反应 1 分钟，随后用淬灭溶液终止反应。部分样本固定用于显微镜观察，部分样本进行链霉亲和素下拉实验，富集生物素化蛋白，通过质谱分析鉴定蛋白质。
6. 质谱分析：对样本进行单罐固相增强样品制备，包括还原、烷基化、酶解、脱盐等步骤。肽段经纳米液相色谱 - 串联质谱（nano LC - MS/MS）分析，原始数据用 MaxQuant 软件和 Andromeda 搜索引擎进行分析，搜索多个数据库，设置多种参数进行蛋白质鉴定和定量。
7. 数据分析与验证：使用 R 语言对质谱数据进行处理，根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）对蛋白质进行分类，去除核糖体相关蛋白后分析其他类别蛋白数量。计算处理组与对照组蛋白质的 log₂倍变化（FC），筛选出丰度变化显著的蛋白质。通过抗体阻断实验和基因敲除实验验证候选受体对金黄色葡萄球菌入侵的影响。

研究结果

1. APEX2 修饰金黄色葡萄球菌的有效性：通过流式细胞术和荧光显微镜观察，证实 APEX2 - YFP - CWT 成功修饰金黄色葡萄球菌，且修饰后的细菌能在 H₂O₂存在下对宿主细胞表面蛋白进行生物素化标记，表明该方法可用于识别金黄色葡萄球菌与宿主细胞的相互作用蛋白。
2. 鉴定潜在的相互作用蛋白：质谱分析共鉴定出 305 种潜在的金黄色葡萄球菌相互作用蛋白。KEGG 通路分析显示，“沙门氏菌感染” 和 “粘着斑” 等感染相关通路显著富集，StringDB 分析发现存在高度连接的蛋白质网络，且积累了多种感染相关蛋白。其中至少 20 种蛋白此前已报道与金黄色葡萄球菌相互作用，验证了实验方法的可靠性。
3. 确定 ASM 依赖的共受体：研究发现金黄色葡萄球菌可通过依赖宿主细胞 Ca^{2 +}信号和溶酶体酶酸性鞘磷脂酶（ASM）的快速途径内化。通过用 ASM 抑制剂（阿米替林）、Ca^{2 +}离子载体（离子霉素）或去除 ASM 底物鞘磷脂（用 β - 毒素处理）阻断该途径，质谱分析发现 11 种蛋白在处理条件下丰度均下降。经抗体阻断和基因敲除实验验证，神经细胞粘附分子（NRCAM）、蛋白酪氨酸激酶 7（PTK7）、黑色素转铁蛋白（MFI2）、蛋白酪氨酸激酶 MET 和 CD109 被确定为金黄色葡萄球菌依赖 ASM 进入宿主细胞的新型共受体。
4. 筛选表面蛋白提高受体命中率：根据细胞表面蛋白图谱，从 305 种候选蛋白中筛选出 89 种已验证的表面蛋白。分析发现，筛选表面蛋白后，已知与病原体或金黄色葡萄球菌相互作用的蛋白比例从 22%（未筛选时）提高到 53%，且在阻断快速内化途径的处理条件下，邻近标记检测到的主要是已知与病原体相互作用的蛋白，表明筛选表面蛋白可有效提高发现金黄色葡萄球菌受体的命中率。

研究讨论

1. 技术优势与局限性：基于 APEX2 的邻近标记技术相比传统方法具有优势，它不依赖分子间的直接相互作用，能检测到病原体 - 宿主接触位点的所有蛋白，且具有较高的时间分辨率。但该技术也存在局限性，可能会检测到感染部位随机定位的旁观者蛋白，导致假阳性结果。此外，APEX2 修饰可能对细菌与宿主蛋白的相互作用产生一定影响，尽管修饰后的细菌仍具有细胞侵袭性，但这种影响的程度尚不清楚。
2. 共受体的作用机制：验证的新型共受体 PTK7、NRCAM、MFI2、CD109 和 MET 在金黄色葡萄球菌入侵过程中发挥重要作用。它们可能作为辅助受体，与初级受体（如 α₅β₁整合素、CD44）协同作用，修饰和加速细菌的内化过程。例如，PTK7 参与细胞外基质重排、细胞骨架和粘着斑相关过程，在金黄色葡萄球菌早期内化中起关键作用；NRCAM 的结构域可能与葡萄球菌的纤维连接蛋白结合蛋白或蛋白 A 相互作用。
3. 对其他病原体研究的启示：ASM 依赖的宿主细胞进入机制在多种病原体中存在，本研究中鉴定的表面分子可能也是其他细菌和病毒的潜在受体。如 MET 和丙氨酰氨肽酶（ANPEP）分别是单核细胞增生李斯特菌和人类冠状病毒的已知进入因子，提示多种病原体可能利用相似的策略入侵宿主细胞。未来研究可进一步比较不同病原体的宿主相互作用组，深入了解病原体感染机制。
4. 研究展望：本研究虽取得重要成果，但仍有许多问题有待解决。例如，未检测到部分已知与金黄色葡萄球菌相互作用的受体，可能是由于其在 HuLEC 表面丰度低、缺乏可生物素化的酪氨酸残基或存在空间位阻。此外，对于筛选出的其他候选受体，还需进一步实验验证其功能。未来可优化实验方法，提高检测准确性，深入探究病原体与宿主细胞相互作用的分子机制，为开发新的抗感染策略提供理论依据。