基于TaqMan-MGB实时荧光定量PCR技术鉴别鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株与野毒株的研究

本研究开发了一种基于hlyC基因SNP位点的TaqMan-MGB qPCR方法，可高效区分鸡滑液囊支原体（MS）MS-H疫苗株与野毒株。该方法检测限达101拷贝/μL，重复性变异系数<2.5%，且与常见禽病原体无交叉反应。临床验证发现免疫MS-H的鸡群中存在L型和C型野毒株共感染现象，首次报道了中国C型野毒株的存在，为MS防控提供了重要技术支撑。

　　

ABSTRACT
鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae, MS）是家禽业重要病原体，其活疫苗MS-H株的广泛使用亟需配套的疫苗株与野毒株鉴别检测技术。本研究基于hlyC基因428 nt位点的单核苷酸多态性（SNP），建立了一种双探针竞争性TaqMan-MGB实时荧光定量PCR（qPCR）方法。

qPCR analytical sensitivity, amplification efficiency, and standard curve
通过构建重组质粒pMD19-T/MS-H和pMD19-T/XL3验证显示，该方法对MS-H和野毒株的检测限分别为1.07×10¹和1.95×10¹拷贝/μL，扩增效率达90.4%-96.1%。标准曲线显示Cq值与模板浓度呈良好线性关系（R²>0.998）。

Specificity and reproducibility assessment
特异性试验证实该方法与MG、AIV等7种常见禽病原体无交叉反应。重复性试验显示批内批间变异系数均<2.5%，其中最低浓度样本（10³拷贝/μL）的批间CV值仅为1.81%。

Analysis of clinical samples
对6个MS-H免疫鸡场的709份样本检测发现：65.87%检出疫苗株，33.29%检出野毒株，其中56份存在混合感染。通过vlhA基因PRR区域测序验证，首次发现免疫鸡群中同时存在L型（XL13）和C型（XL12）野毒株，后者与中国已报道毒株K1的序列相似性达99.44%。

Discovery of type C of MS field strains
基因组比对显示，C型野毒株XL12在hlyC基因关键位点与疫苗株存在显著差异。该发现打破了"MS-H疫苗株属于C型"的传统认知，揭示了野毒株可能存在更复杂的基因型分布。

DISCUSSION
相比既往基于obg/oppF基因SNP的检测方法，本研究的hlyC靶标具有更高稳定性——MS-H株在obg基因367 nt位点已报道存在回复突变风险。临床样本测序结果100%符合qPCR检测，证实该方法可作为监测免疫鸡群野毒株感染的可靠工具。

MATERIALS AND METHODS
实验采用河北工程大学分子生物学实验室保存的10株MS野毒株（如XL3）和MS-H疫苗株（Vaxsafe?）。引物探针针对hlyC基因281-561 nt区域设计，采用2×AceQ qPCR Probe Master Mix体系，在ABI 7500仪器上运行40个循环（95℃ 10s，60℃ 34s）。临床样本通过煮沸法提取DNA，vlhA基因分型采用MSConsF/R引物对。

该研究不仅建立了首个基于hlyC基因的MS DIVA检测标准，还揭示了疫苗免疫背景下MS野毒株的复杂传播动态，为完善"免疫-监测-净化"综合防控策略提供了关键技术支撑。