一种体内 “转换模型” 揭示肺巨噬细胞中 RanBP9 的新相互作用：开启巨噬细胞功能调控研究新视角

《Cell Death Discovery》：An in vivo “turning model” reveals new RanBP9 interactions in lung macrophages

为探究支架蛋白 Ran 结合蛋白 9（RanBP9）在巨噬细胞中的生物学功能，研究人员构建 RanBP9-TurnX 小鼠模型，发现 RanBP9-V5 和 RanBP9-3xHA 相关蛋白组存在显著差异，揭示其在调节巨噬细胞生物能量学和免疫功能中的关键作用，为相关研究提供新方向。

　　在生命科学的微观世界里，细胞内的各种蛋白质如同精密仪器中的微小零件，各自承担着独特的使命，共同维持着细胞的正常运转。其中，Ran 结合蛋白 9（RanBP9）作为支架蛋白，是广泛表达的 C 末端至 LisH（CTLH）复合体的关键成员。然而，就像被迷雾笼罩一般，它在巨噬细胞以及其他表达该蛋白的细胞类型中的生物学功能一直模糊不清。尽管此前研究发现 RanBP9 和 CTLH 复合体参与多种生理和病理过程，如胚胎发育、癌症等，但由于研究方法的局限性，大多数关于 RanBP9 相互作用和功能的认知，多来自癌细胞研究，这些研究结果难以准确反映其在正常生理状态下的作用。此外，在体内研究 RanBP9 时，不同细胞类型之间的动态相互作用、蛋白表达的波动，以及与 RanBP10 高度相似导致的难以特异性识别等问题，都成为了阻碍研究前进的重重障碍。

为了驱散这些迷雾，解开 RanBP9 在正常生理条件下的功能谜题，美国俄亥俄州立大学等机构的研究人员展开了深入探索。他们精心构建了一种全新的小鼠模型 ——RanBP9-TurnX。研究发现，通过 Cre 介导的重组，RanBP9-3xHA 能够高效地转变为 RanBP9-V5。利用这一特性，研究人员将 RanBP9-TurnX 小鼠与 LysM-Cre 转基因小鼠杂交，成功地在肺巨噬细胞中对 RanBP9 的相互作用进行了细致研究。这一研究成果意义重大，它首次揭示了在生理条件下肺特异性 RanBP9 相关的相互作用组，为深入理解 RanBP9 和 CTLH 复合体在巨噬细胞中的作用机制打开了新的大门。该研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是基因编辑技术 CRISPR/Cas9，通过它将 loxP3xHA-loxP-V5 盒敲入 RanBP9 基因的 C 末端，构建出 RanBP9-TurnX 小鼠模型；其次是免疫沉淀（IP）技术，从不同组织的细胞裂解物中富集与 RanBP9 相互作用的蛋白质；最后结合质谱分析（MS），鉴定这些相互作用的蛋白质，从而全面解析 RanBP9 的相互作用组。

下面来看具体的研究结果：

• RanBP9-TurnX 等位基因的生成：研究人员借助 CRISPR/Cas9 基因组编辑策略，将 loxP3xHA-loxP-V5 盒成功敲入 RanBP9 基因 C 末端的终止密码子前。经过一系列筛选和验证，获得了 RanBP9-TurnX 纯合子小鼠，这些小鼠表现正常，证明该等位基因不会导致致死性，且能产生功能完整的 RanBP9 标记蛋白。
• Cre-Lox 重组使 RanBP9-3xHA 转变为 RanBP9-V5：通过将 RanBP9-TurnX 杂合子小鼠与 EIIa-Cre 小鼠杂交，研究发现 Cre-Lox 重组能够顺利将 RanBP9-3xHA 转变为 RanBP9-V5。Western Blot 分析结果显示，在不同器官中，RanBP9 的标签转换正如预期发生，且对其蛋白表达没有产生负面影响。
• RanBP9-V5 可从 E2aBP9V5 小鼠器官中有效免疫沉淀：研究人员对肺、肝和骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）进行免疫沉淀实验，结果表明 RanBP9-V5 能够成功免疫沉淀，并且与 CTLH 复合体的核心成分 Gid8 和 Maea 共沉淀，这充分证明 RanBP9-V5 参与了 CTLH 复合体的形成。
• LysM-Cre 介导的重组使肺中表达 RanBP9-V5：将 RanBP9-TurnX 小鼠与 LysM-Cre 小鼠杂交后，通过 Western Blot 分析全肺裂解物，发现其中同时存在 RanBP9-3xHA 和 RanBP9-V5，这表明 LysM-Cre 介导的重组能够使肺中的 RanBP9-V5 成功表达。
• RanBP9-TurnX 模型可有效免疫沉淀 CTLH 复合体：研究人员利用该模型，对 LysMBP9X 和 LysMBP9 WT 小鼠进行免疫沉淀实验，结果显示，3xHA 和 V5 免疫沉淀都能够成功富集 RanBP9 的相互作用蛋白，并且 RanBP9-3xHA 和 RanBP9-V5 都参与了肺蛋白裂解物中的 CTLH 复合体。
• RanBP9-3xHA 和 RanBP9-V5 免疫沉淀的蛋白质组存在显著差异：对比 HA 和 V5 免疫沉淀的蛋白质组，发现两者差异显著，超过 90% 的蛋白质不同，且两个标签免疫沉淀的蛋白质组中都包含许多此前未报道的 RanBP9 相互作用蛋白，这有力地证明了 RanBP9 和 CTLH 复合体具有细胞类型特异性的相互作用和功能。
• 肺 RanBP9 免疫沉淀的相互作用组揭示其参与多种生物学过程：通过 Metascape 分析，研究人员发现 RanBP9 和 CTLH 复合体在正常肺中直接或间接与多种参与基本生物学过程的蛋白质相互作用，包括 RNA 剪接、转录、细胞周期调控、DNA 损伤修复、代谢以及免疫反应等。
• RanBP9-V5 相互作用组富含在巨噬细胞中有已知功能的蛋白质：分析 RanBP9-V5 免疫沉淀的相互作用组发现，其中富含在巨噬细胞中具有重要作用的蛋白质，如 Lyz2、Msr1 等，这些蛋白质参与巨噬细胞的发育、功能调节、免疫反应以及代谢等过程。同时，RanBP9-V5 还与参与 DNA 损伤修复和先天免疫反应的蛋白相互作用，表明其在这些过程中也发挥着重要作用。
• RanBP9 存在于线粒体富集的组分中并与 HtrA2 共免疫沉淀：研究人员通过对缺乏 RanBP9、RanBP10 或两者的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行分析，发现 RanBP9 和 RanBP10 都存在于线粒体富集的组分中。免疫沉淀实验进一步证实 RanBP9 与线粒体蛋白 HtrA2 存在相互作用，这表明 RanBP9 可能在线粒体功能中发挥作用。

综上所述，本研究成功构建了 RanBP9-TurnX 小鼠模型，这一模型为研究 RanBP9 和 CTLH 复合体在不同细胞类型中的动态相互作用提供了强大的工具。通过该模型，研究人员首次全面地揭示了正常肺细胞中 RanBP9 的相互作用组，发现了许多新的相互作用蛋白，这些发现为深入理解 RanBP9 在巨噬细胞功能调节中的作用机制奠定了坚实的基础。同时，研究还表明 RanBP9 和 CTLH 复合体在调节巨噬细胞的生物能量学和免疫功能方面具有关键作用，这为进一步探究相关疾病的发病机制和治疗策略提供了重要的理论依据。未来，基于这一研究成果，有望在巨噬细胞相关疾病的研究和治疗领域取得更多突破。