双 Cas12a 与多重 crRNA 的 CRISPR 策略：超灵敏检测卵巢癌新型 circRNA 生物标志物，助力早期精准诊断

《BMC Cancer》：Dual Cas12a and multiplex crRNA CRISPR strategy ultrasensitive detection novel circRNA biomarker for the diagnosis of ovarian cancer

为解决卵巢癌（OC）缺乏有效早期筛查和诊断措施，现有临床生物标志物存在局限性的问题，研究人员开展了寻找新型生物标志物并构建敏感检测方法的研究。他们发现新型 circRNA 生物标志物 hsa_circ_0049101，构建 DCMC-CRISPR 检测策略，其灵敏度高，对 OC 诊断有重要意义。

　　卵巢癌，这个隐藏在女性健康阴影中的 “杀手”，一直以来都让医学界倍感棘手。它在早期悄无声息，等到症状出现时往往已到晚期，导致患者的 5 年生存率极低。目前临床常用的血清肿瘤标志物筛查方法，如 CA125（癌抗原 125）和 HE4（人附睾蛋白 4），虽然在一定程度上有助于诊断，但它们的假阳性率高、灵敏度不足，就像不够精准的 “探测器”，无法准确揪出早期的癌细胞。而风险卵巢恶性肿瘤算法（ROMA）指数，即便结合了多种因素，在灵敏度和特异性方面仍存在局限。与此同时，循环 RNA（circRNA）作为一类新兴的非编码 RNA，因其独特的闭合环状结构，在血浆和血清中稳定性高，被视为潜在的癌症诊断生物标志物。然而，circRNA 在血液中的含量极低，检测和定量困难，传统的检测方法，如逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），不仅操作复杂，灵敏度也不尽如人意。因此，寻找更有效的卵巢癌生物标志物和构建高灵敏度的检测方法迫在眉睫。

为了攻克这些难题，大连理工大学生物工程学院教育部智能生物制造重点实验室等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一系列研究，旨在寻找新型 circRNA 生物标志物，并构建一种超灵敏的检测策略。最终，他们发现了新型 circRNA 生物标志物 hsa_circ_0049101（circMUC16），并成功构建了结合逆转录滚环扩增（RT-RCA）和规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas12a 的检测策略（DCMC-CRISPR）。这一研究成果发表在《BMC Cancer》上，为卵巢癌的早期诊断带来了新的希望。

研究人员在这项研究中主要运用了以下关键技术方法：通过数据库挖掘和 circRNA 测序（circRNA-Seq）筛选 circRNA 生物标志物；利用 RT-RCA 对目标 circRNA 进行等温预扩增；设计双 Cas12a 蛋白（LbCas12a 和 FnCas12a）与多重 crRNA 组成 DCMC-CRISPR 系统进行检测；从辽宁癌症医院及研究所获取 22 例 OC 患者和 28 例健康供体的临床血液样本进行检测分析。

下面来看具体的研究结果：

1. circMUC16 是潜在的卵巢癌生物标志物：研究人员对 MUC16 基因相关 circRNA 进行分析，发现 exon 68 在 circRNA 的反向剪接位点（BSJ）出现频率高。circRNA-Seq 分析得到四个潜在上调的 circRNAs，其中 circMUC16 由 exon 66 - 67 - 68 组成，在 OC 中表达上调，且与上皮细胞的增殖和迁移密切相关。进一步在不同妇科细胞系中验证，发现 circMUC16 在 OC 细胞系中高表达，具有细胞特异性，有作为诊断靶点的潜力。
2. 验证扩增系统：通过体外转录和 RNA 环化合成 circMUC16，经 RNase R 消化实验证明 circRNA 合成成功，其稳定性高于线性 RNA。利用 RT-RCA 技术，设计特异性引物在 circMUC16 的 BSJ 位点识别目标，经琼脂糖凝胶电泳验证，RT-RCA 能有效扩增 circRNA，且扩增产物浓度随反应时间增加，测序结果也证实了 RT-RCA 的选择性。
3. 验证 DCMC-CRISPR：研究发现基于 PAM 位点设计的 crRNA 识别反应效率更高。比较不同 crRNAs 的检测灵敏度，筛选出性能较好的 crRNAs 进行组合。实验表明，LbCas12a/LbcrR1 和 FnCas12a/FncrR1 组合能显著提高检测灵敏度，验证了 DCMC-CRISPR 的可行性。
4. 优化 DCMC-CRISPR：“一锅法” 检测中 RT-RCA 反应会干扰 CRISPR 反应，因此选择两步法。对 RT-RCA 和 CRISPR/Cas12a 反应条件进行优化，确定最佳反应条件为 Cas12a 与 crRNA 比例 1:1、Cas12a 浓度 400 nM、反应温度 42℃。
5. DCMC-CRISPR 的灵敏度和特异性：评估不同 crRNA 组合的检测灵敏度，发现组合 crRNAs 能提高检测灵敏度，当四个 crRNAs（L1 + L3 + F1 + F3）组合时，检测灵敏度比单 crRNA 和三 crRNA 组合提高 4 - 11 倍，检测限低至 0.5 fM。该检测方法能区分单碱基错配，混合高浓度线性 RNA 也不影响 circRNA 的检测效率，具有良好的细胞特异性和抗干扰能力。
6. 检测机制：比较 LbCas12a 和 FnCas12a 在 TTTV 和 TTV PAM 位点的检测效率，发现二者可互补，相应 crRNA 组合显示出检测优势。检测机制研究结果证实，CRISPR 检测系统的灵敏度与 PAM 位点和 crRNAs 位置密切相关。
7. 临床样本检测：用 DCMC-CRISPR 和 RT-qPCR 检测临床血液样本中的 circMUC16，并与临床常规血清标志物 CA-125、HE4 和 ROMA 指数比较。结果显示，DCMC-CRISPR 能正确识别大部分阳性病例，与 RT-qPCR 一致性高。DCMC-CRISPR 检测 circMUC16 的灵敏度和特异性分别为 95.5% 和 100%，优于 CA-125、HE4 和 ROMA 指数，对早期 OC 检测效果显著。

研究结论和讨论部分表明，研究人员成功筛选出有效生物标志物 circMUC16，并构建了超灵敏的 DCMC-CRISPR 检测策略。该策略检测范围广、检测限低，比单 crRNA 的 CRISPR/Cas12a 系统灵敏度高 4 - 11 倍，在当前样本检测中能高特异性区分卵巢癌患者和健康对照。不过，该平台也存在一些局限性，如 “一锅法” 检测灵敏度降低、样本制备步骤复杂等。未来需要进一步优化检测步骤，简化样本制备流程，并开展大规模多中心研究，以推动其临床应用。这项研究为卵巢癌的早期诊断提供了新的方向和有力工具，有望在临床实践中发挥重要作用，帮助医生更早、更准确地发现卵巢癌，提高患者的生存率和生活质量。