KRIT1 杂合突变在脑海绵状畸形患者来源 iPSC 模型中的关键作用及研究新突破

《Cell Reports》：KRIT1 heterozygous mutations are sufficient to induce a pathological phenotype in patient-derived iPSC models of cerebral cavernous malformation

推荐阅读：本文利用携带 KRIT1 杂合突变的家族性脑海绵状畸形（CCM）患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs），构建疾病模型。研究发现 KRIT1 杂合突变可引发内皮细胞异常，为 CCM 发病机制提供新见解，为开发针对性疗法奠定基础，极具科研价值。

　　

研究背景

脑海绵状畸形（Cerebral Cavernous Malformation，CCM）是一种神经血管疾病，由 CCM 基因（如 KRIT1（CCM1）、CCM2 或 PDCD10（CCM3））功能丧失突变引发，导致中枢神经系统出现易渗漏、出血的桑葚状血管病变，可引发头痛、癫痫等症状。CCM 分为散发性和家族性，家族性 CCM 由 CCM 基因的常染色体显性遗传突变引起，其中 KRIT1 杂合突变最为常见。目前 CCM 缺乏药物治疗，仅手术可治愈，因此亟需开发人源化疾病模型研究其发病机制和验证潜在药物。

CCM 蛋白形成三聚体复合物，调节内皮细胞静止和稳态的生理途径。KRIT1 主要位于质膜的细胞 - 细胞连接处，与多种蛋白相互作用以稳定内皮连接和维持屏障完整性。尽管对 CCM 的理解有所增加，但 KRIT1 杂合突变导致内皮细胞单倍体不足的细胞后果尚不清楚。本研究旨在利用携带 KRIT1 突变的家族性 CCM 患者来源的 iPSCs 建立疾病模型，探索 CCM 早期病理事件。

研究方法

1. iPSCs 的生成：从参与 Treat_CCM（ClinicalTrials.gov:NCT03589014）临床试验的 3 例家族性 CCM 患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中，通过 Yamanaka 因子介导的附加体重编程生成 iPSCs。对 iPSCs 进行基因检测、基因组分析、多能性验证和三系分化能力检测。
2. 血管化类器官的构建与分析：利用 CCM 患者来源的 iPSCs 生成血管化类器官，通过全组织共聚焦显微镜成像、MATLAB 软件 REAVER 分析等方法，研究类器官的血管结构和表型。同时，采用转录因子介导的分化方法，将 iPSCs 分化为内皮细胞（iECs），并对其进行功能和表型分析。
3. 体外共培养实验：将 CCM 患者或健康对照的 iECs 与小鼠脑海马体切片进行体外共培养，通过免疫染色和 RNA 测序（RNA-seq）分析，研究 CCM 内皮细胞对正常血管的影响以及其在脑微环境中的转录变化。
4. 寻找共同转录特征：对 CCM 患者来源的 iECs 进行转录组分析，寻找与健康对照相比共同上调的基因，并在患者来源的脑活检组织中验证关键基因的表达。

研究结果

1. iPSCs 的成功生成与鉴定：成功从 3 例携带不同 KRIT1 杂合突变（c.778_779insT、c.845 + 1G>C、c.1440delC）的 CCM 患者中生成 iPSCs，这些 iPSCs 无大规模遗传异常，具有多能性且能分化为三个胚层细胞。
2. CCM 来源的血管化类器官存在结构异常：CCM 患者来源的血管化类器官呈现出异常且不连续的 PECAM - 1 阳性血管网络，有海绵状瘤样异常，血管直径和面积分数增加。免疫染色显示，形成这些异常的内皮细胞表达动脉血管命运相关标记。
3. CCM 患者来源的 iECs 存在细胞 - 细胞连接缺陷和屏障功能受损：CCM - 突变的 iECs 形成指状 VE - cadherin 细胞 - 细胞连接，与 F - actin 应力纤维相关，导致跨内皮电阻（TEER）降低，内皮屏障不稳定。
4. ETV2 iPSC - 来源的内皮细胞具有动静脉转录特征并表达 CCM 相关基因：RNA - seq 分析表明，ETV2 iECs 具有动静脉转录特征，且 CCM 患者来源的 iECs 中存在差异表达基因（DEGs）。其中，KLF4 等 CCM 相关基因上调，但不一定导致内皮细胞过度增殖。
5. CCM 患者来源的内皮细胞重塑小鼠脑外植体的现有血管：将 CCM 患者来源的 iECs 注射到小鼠脑外植体中，发现其可整合到正常血管中并引起血管异常，如血管直径增加和形态改变，表明杂合突变在 CCM 中具有重要作用。
6. CCM 来源的内皮细胞在接触脑外植体时获得病理转录特征：与脑切片共培养后，CCM 患者来源的内皮细胞经历更显著的转录变化，涉及细胞增殖、细胞外基质组织和血管生成等生物学过程的基因上调。
7. 鉴定出 CCM 患者来源内皮细胞的共同转录特征：在 CCM 患者来源的 iECs 中发现 33 个共同上调的基因，其中 PEG3 在患者样本和脑活检组织中均高表达，而在健康成人脑内皮细胞中表达较低。

研究讨论

本研究利用患者来源的 iPSCs 建立了 CCM 疾病模型，揭示了 KRIT1 杂合突变在 CCM 发病机制中的重要作用。CCM 患者来源的血管化类器官和 iECs 表现出多种异常，包括血管结构异常、细胞 - 细胞连接缺陷和转录变化。这些异常可能与 CCM 的病理过程相关，如血管渗漏和病变形成。

研究还发现，CCM 患者来源的内皮细胞可重塑正常血管，且在接触脑微环境时获得病理转录特征，这表明 CCM - 缺陷的内皮细胞与正常脑血管之间存在相互作用，可能共同促进疾病的发展。此外，PEG3 在 CCM 患者来源的内皮细胞中高表达，可能是 CCM 发病机制中的一个重要分子，但其在血管生物学中的具体功能仍需进一步研究。

然而，本研究存在一定局限性。研究仅使用了体外和体内外模型，缺乏体内模型来真实再现 CCM 进展中的重要因素，如脑微环境、免疫细胞和血液凝固蛋白等。此外，研究仅使用了女性供体的 iPSCs，且血管化类器官缺乏流动这一重要的外在因素。未来的研究需要解决这些问题，以更深入地了解 CCM 的发病机制并开发有效的治疗方法。

本研究为 CCM 的研究提供了新的见解和实验基础，有助于推动针对 CCM 的药物研发和治疗策略的发展。