《Cell Reports》：Spatial proteomics of ER tubules reveals CLMN, an ER-actin tether at focal adhesions that promotes cell migration
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本文利用 TurboID - 基于邻近标记和 CRISPR 敲入技术，绘制了人类内质网（ER）网络的蛋白质组图谱，发现 CLMN 是一种 ER - 肌动蛋白连接蛋白，定位于粘着斑，影响细胞迁移，为理解 ER 功能组织和细胞迁移机制提供新视角。
### 内质网的结构与功能及研究背景
内质网（ER）是真核细胞中一个庞大且结构功能多样的膜网络，由片层、微管和核膜组成，不同区域具有特定形态和功能。比如，ER 片层是核糖体的停靠位点，而 ER 微管则参与细胞器间脂质、离子交换等过程 ，还能协调线粒体或内体分裂。ER 的结构会随代谢变化而改变，但其如何维持自身结构以及功能如何在形态区域内组织，仍未完全明确。已有研究表明，ER 形态受一些蛋白如网状蛋白（RTNs）、CKAP4（CLIMP - 63）等影响，也与细胞骨架存在相互作用，但 ER 与肌动蛋白之间的联系却知之甚少。
研究方法与关键发现
为深入探究 ER 形态区域相关蛋白，研究人员在 U2OS 人骨肉瘤细胞中，运用基于 CRISPR - Cas9 的亚细胞器蛋白质组学方法。该方法借助 TurboID 邻近标记生物素连接酶和内源性 CRISPR - Cas9 敲入标记技术，对 ER 不同形态亚区域的蛋白进行标记。研究人员选取了 RTN4（ER 微管标记蛋白）、CKAP4（ER 片层标记蛋白）、SYNE4（外核膜标记蛋白）、LBR（内核膜标记蛋白）和 CANX（一般 ER 标记蛋白）等作为标记蛋白，构建了相应的细胞系，并通过蛋白质组学分析，发现了在 ER 微管中高度富集的蛋白 CLMN。
CLMN 蛋白的特征与功能研究
CLMN 是一种含钙调蛋白同源（CH）结构域和跨膜（TM）结构域的蛋白，此前功能和定位不明。研究显示，CLMN 定位于 ER 微管，其 CH 结构域可与 F - 肌动蛋白结合，且在细胞基底外侧表面的粘着斑（FAs）处富集，与 paxillin 阳性的 FAs 存在共定位现象，这表明 CLMN 可能作为 ER - 肌动蛋白的连接蛋白发挥作用。
通过对 CLMN 进行结构 - 功能分析发现，其 CH1 - CH2 结构域对与特定 F - 肌动蛋白池的结合至关重要，缺失 CH1 或 CH1 - CH2 结构域会影响其在基底外侧斑的定位。同时，CLMN 的 TM 结构域决定了其在 ER 微管的定位，通过替换 TM 结构域实验表明，TM 结构域的长度和氨基酸组成影响其在核膜的定位，较短的 TM 结构域及特定氨基酸序列使 CLMN 被排除在核膜之外。
CLMN 对细胞生理和行为的影响
研究发现，CLMN 缺失会导致细胞出现多种异常表型。在细胞形态方面，CLMN - 缺失的细胞在细胞周边出现 F - 肌动蛋白束积累，α - 肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白 II 成分 MYH9 在应力纤维处聚集，表明 CLMN 对维持 F - 肌动蛋白束应力纤维的动态平衡至关重要。在细胞迁移方面，CLMN 缺失显著降低了 MDA - MB - 231 细胞的迁移速度，而过表达 CLMN 则促进细胞迁移，缺失 CH1 - CH2 区域会部分削弱这种促进作用，这充分说明 CLMN 在细胞迁移过程中发挥着重要作用。此外，CLMN 还影响粘着斑的密度和周转，CLMN 缺失会使 paxillin 阳性粘着斑数量增加，且在诺考达唑（nocodazole）洗脱实验中，粘着斑密度无法正常降低，表明 CLMN 促进粘着斑的解聚。
CLMN 对 ER - 肌动蛋白相互作用及钙信号的影响
CLMN 能够介导 ER 微管与肌动蛋白的连接，过表达 CLMN 可增强 ER 微管在富含肌动蛋白的细胞周边区域的定位，增加该区域 ER 微管的比例。由于 ER 是细胞内钙的主要储存库，且钙信号在粘着斑解聚和细胞迁移中起关键作用，研究人员进一步探究了 CLMN 对钙信号的影响。通过使用 GCaMP6f 这一敏感的基因编码钙生物传感器，研究发现过表达 CLMN 会增加细胞周边钙爆发事件（GCaMP6f 焦点）的发生率，且这些焦点与 ER 的关联更紧密；而 CLMN 缺失则导致细胞周边钙爆发事件减少。这表明 CLMN 对维持正常的钙信号至关重要，其缺失会改变局部钙动态。
CLMN 对 ER - PM 接触和 STIM1 极化的影响
研究还发现，CLMN 影响 ER - 质膜（ER - PM）接触位点的定位和 STIM1 的极化。在迁移细胞中，CLMN 缺失导致 ER - PM 生物标志物 MAPPER 和 STIM1 的极化显著降低，这表明 CLMN 可能通过影响 ER - 肌动蛋白接触来调节局部钙信号，进而支持局部 F - 肌动蛋白动力学、粘着斑周转和细胞迁移。
研究意义与展望
本研究首次明确了 CLMN 作为 ER - 肌动蛋白连接蛋白的重要作用，其在调节 F - 肌动蛋白结构、粘着斑动态和细胞迁移方面发挥着不可或缺的功能。这一发现为理解细胞器生物学中 ER 结构亚区域如何影响细胞骨架动力学，以及 ER - 肌动蛋白相互作用如何调控粘着斑动态和细胞迁移提供了重要线索。由于维持 ER 微管对神经元、肌肉等组织的发育至关重要，且细胞迁移在组织发育和维持中具有关键作用，因此该研究成果在细胞生物学的组织发育和维持等多个领域具有重要的潜在价值。然而，目前研究仍存在一些局限性，例如在成像技术上，对 GCaMP6f 在细胞不同区域成像存在限制，对钙信号的来源也尚未明确，TurboID 标记细胞系的表达差异也可能影响实验结果。未来研究需进一步深入探究 CLMN 在不同细胞类型，如神经元中的作用，以及其在三维迁移或整个生物体中的功能机制。
