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纳米孔直接 RNA 测序（dRNA-seq）在 RNA 生物学研究极具潜力，却受限于样本多重分析技术。研究人员开发 WarpDemuX 方法，实现快速准确的适配体条形码标记与解复用，还能进行实时富集。这为 dRNA-seq 提供了高效方案，推动转录组学研究。
在生命科学的微观世界里，RNA 的研究一直是热门领域。纳米孔直接 RNA 测序（dRNA-seq）作为一项新兴技术，为深入探索 RNA 生物学提供了独特视角。它无需将 RNA 转化为 cDNA，就能直接识别 RNA 异构体，还能保留天然 RNA 碱基修饰，让科学家们有机会研究动态的表观转录组。然而，这项技术在实际应用中却遭遇了 “拦路虎”。目前缺乏准确且经济高效的样本多重分析方法，这使得 dRNA-seq 的应用受到极大限制，就像一辆性能卓越的赛车，却因为缺少关键零件而无法在赛道上尽情驰骋。
为了解决这一难题，来自德国罗伯特?科赫研究所（Robert Koch Institute）、柏林自由大学（Freie Universit?t Berlin）、亥姆霍兹 RNA 感染研究中心（Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research）等机构的研究人员携手开展研究。他们致力于开发一种新方法，以突破 dRNA-seq 在样本多重分析上的瓶颈。经过不懈努力，研究人员成功开发出 WarpDemuX，这是一种超快速且高度准确的适配体条形码标记和解复用方法，适用于使用 SQK - RNA002 和 SQK - RNA004 化学试剂的 dRNA-seq。相关研究成果发表在《Nature Communications》上，为 RNA 研究领域带来了新的曙光。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。在信号处理方面，通过对原始纳米孔信号进行快速处理，有效减少数据噪声，降低因驻留时间变化产生的虚假时间相关性；利用动态时间规整距离（DTWD）核与支持向量机（SVM）相结合的算法进行条形码分类，这种算法能够精准捕捉条形码信号的细微差异，提高分类的准确性；通过合成带有内联 RNA 条形码和定制 RTA 适配体的双条形码 RNA 分子，并对其进行测序，为训练分类器提供可靠的标签数据 。
研究结果
- 高解复用准确性、产量和速度：研究人员将条形码序列置于可定制的 RTA 适配体中，采用基于信号的解复用策略。通过将 DTW 算法集成到 SVM 分类器中，构建了 SVM - DTWD 模型。实验表明，在置信度阈值为 0.5 时，WarpDemuX 的解复用准确率达到 97%，高于 DeePlexiCon（DPC）的 92%，产量也更高（未分类比例为 7.7%，而 DPC 为 11.4%），且计算时间仅为 DPC 的十分之一。
- 优化条形码提高性能：研究人员实施了计算框架来获取具有不同信号特征的优化 RTA 条形码集。实验显示，使用优化条形码后，准确性和产量均得到提高。例如，4 个优化条形码（WDX4）的模型准确率达到 99%，产量为 96%；扩展到 12 个条形码（WDX12）时，准确率仍保持在 98%（加权平均） 。
- SARS-CoV-2 病毒的快速表型分析：研究人员利用 WarpDemuX 对两种基因不同的 SARS-CoV-2 病毒进行快速表型分析。他们对感染后不同时间点的细胞和病毒上清液提取 RNA，进行条形码标记后在单个 Minion R9.4.1 流动池中测序。分析发现，感染过程中不同时间点的读取长度分布存在差异，不同亚基因组 RNA（sgRNA）的相对丰度也不同 。
- 条形码平衡和低丰度样本富集：研究人员利用 WarpDemuX 的分类速度优势，实现了 dRNA-seq 的超快速自适应采样。通过修改 MinKNOW 软件，使其能更早地向 WarpDemuX 管道提供信号数据，并开发自定义决策逻辑。实验结果显示，81% 的分类在检测到 poly (A) 尾后 60 毫秒内完成，98% 在 200 毫秒内完成 。
- 适应 RNA004 化学试剂保持高性能：牛津纳米孔技术公司发布新的直接 RNA 测序化学试剂 SQK - RNA004 后，研究人员对 WarpDemuX 进行适配。实验表明，WarpDemuX 在不同条形码配置下均表现出稳健的性能。较小的条形码集（WDX4 - WDX6）准确率可达 99.5%，产量在 90 - 95% 之间；较大的条形码集（WDX8 - WDX10）准确率为 99%，产量在 87 - 91% 之间；WDX12 的准确率为 98 - 99%，产量为 79 - 90% 。
在研究结论与讨论部分，WarpDemuX 的出现为 dRNA-seq 提供了一种高效的样本多重分析解决方案。它具有高分类速度、准确性、产量和可扩展性等优势，还能实现自适应采样，用于条形码平衡和低丰度样本富集。与其他相关工具相比，WarpDemuX 在性能上有显著提升 。不过，研究人员也指出，虽然 WarpDemuX 性能优异，但随着条形码数量增加，可能会达到分类能力的饱和点。未来可通过延长条形码长度、开发新的信号模型等方式进一步优化。总体而言，WarpDemuX 的开发为转录组学和表观转录组学研究注入了新动力，有望推动相关领域取得更多突破，让我们对 RNA 的奥秘有更深入的了解。
