《Analytical Biochemistry》：nCas9-based method for rolling-circle DNA substrate generation
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在滚环 DNA 复制研究中，现有制备滚环 DNA 底物的方法存在局限。研究人员开展基于 nCas9 制备滚环 DNA 底物的研究，成功构建出可精准控制缺口大小和叉位的底物，且该底物支持高效 DNA 复制，为相关研究提供了新策略。
滚环 DNA 复制作为一种独特的 DNA 复制机制，如同一场微观世界里有条不紊的 “复制盛宴”。它能以环形 DNA 模板为 “蓝图”，持续不断地复制出长长的 DNA 产物。在分子诊断领域，它像一位精准的 “侦探”，助力识别各种疾病相关的 DNA 线索；在 DNA 测序中，为测序工作提供稳定可靠的模板支持；在纳米技术里，又如同神奇的 “工匠”，参与构建各种精妙的纳米结构；同时，也是体外 DNA 复制研究的重要 “利器”。
然而，这场 “盛宴” 却面临着一些挑战。滚环复制反应的效率在很大程度上依赖于滚环 DNA 模板的质量，就像美味佳肴的品质取决于食材的好坏一样。目前，创建滚环 DNA 底物的方法主要有三种。第一种方法是通过退火部分互补的寡核苷酸叉到单链质粒的一端，再借助 DNA 聚合酶进行引物延伸，将单链质粒转变为双链质粒。但这种方法就像驾驶一辆方向盘不太灵活的汽车，对 DNA 聚合酶的效率依赖较高，而且难以精确控制缺口大小。第二种方法是通过在双链质粒模板的缺口处进行链置换 DNA 合成来制备底物，可这样得到的底物在叉处缺乏缺口，还会产生长度不一的 5′- 尾巴，就像制作的衣服尺寸不合身。最后一种方法是利用位点特异性切口酶在双链质粒中创建单链缺口，虽然能控制缺口大小和瓣长度，但改变叉位置和缺口大小需要额外的克隆步骤来引入或去除切口酶识别位点，操作起来十分繁琐，就像给精密仪器调整参数却受到重重限制。
为了解决这些问题，来自国外研究机构的研究人员开展了一项基于 nCas9（nickase Cas9，一种经过改造的 Cas9 酶，可在引导 RNA 的作用下靶向特定 DNA 序列并产生单链切口）的研究。他们致力于开发一种新的策略，以制备能够精准控制缺口大小和叉位置的滚环 DNA 底物。最终，研究人员成功创建了一种基于 nCas9 的方法，能够有效制备滚环 DNA 底物，且该底物在体外单分子滚环 DNA 复制实验中表现出色，这一成果为相关领域的研究开辟了新的道路，发表在《Analytical Biochemistry》上。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用 nCas9 与引导 RNA（gRNA）特异性结合，对质粒 DNA 进行定点切割，在特定位置引入单链切口；二是通过添加互补捕获寡核苷酸，去除切割产生的小片段，形成带缺口的质粒；三是进行退火和连接反应，将生物素化的叉状寡核苷酸连接到缺口处，构建出滚环 DNA 模板；四是运用限制性内切酶（如 EagI 和 NaeI）消化验证模板的正确性；五是采用体外单分子滚环复制实验、单分子成像技术以及相关数据分析方法，检测模板支持 DNA 复制的效率、速率和产物长度等指标 。
研究结果
- 模板构建：研究人员通过三步操作，利用 nCas9 在质粒 DNA 上引入四个切口，成功创建了一个 35 - nt 长的 DNA 缺口。在这个过程中，nCas9 - gRNA 复合物如同 “分子剪刀”，精准地在四个特定位置切割 DNA，产生的小片段被互补捕获寡核苷酸 “清理” 掉，为后续生物素化的叉状寡核苷酸 “安营扎寨” 创造了条件。最终，该方法获得了 47 ± 4 %（N = 3）的总体效率，意味着近一半的实验都成功构建出了所需的模板。
- 验证：为确保滚环模板的正确组装，研究人员使用了两种限制性内切酶进行 “检验”。EagI 用于验证缺口的存在，因为它在 pUBER 质粒上有两个识别位点，正常情况下切割会产生两个线性片段，但对于成功构建的滚环底物，由于一个识别位点位于缺口内无法被切割，所以理论上只会产生一个 18 - kb 的线性片段。实验结果正如预期，这表明所有模板都含有缺口。NaeI 则用于确认叉状寡核苷酸是否成功连接到 DNA 底物上，它能在质粒 DNA 和滚环模板上切割出五个位点，产生五个片段。若叉未成功退火和连接，其中一个切割位点会位于缺口内，相应的 160 - bp 和 354 - bp 条带就不会出现。而实际实验中，这三条最低的条带都存在，有力地证明了叉状寡核苷酸成功连接。
- 单分子可视化：研究人员选用大肠杆菌（E. coli）DNA 复制系统进行体外单分子滚环复制实验。他们将构建好的模板加载到显微镜盖玻片表面的微流控流动池中，加入 SYTOX Orange 染料和所有纯化的大肠杆菌复制体组件，启动复制过程。在这个过程中，新合成的 DNA 会在缓冲液的层流作用下被拉伸，就像被一双无形的手慢慢展开，通过 SYTOX Orange 染料就能清晰地观察到。实验结果显示，该滚环模板的复制效率为 44 ± 4 %，与其他底物的复制效率相当。同时，研究人员还能监测单个模板随时间的复制情况，测量复制的瞬时速率（764 ± 7 bp/s）和两分钟后最终产物的长度（75 ± 3 kbp），这些数据与之前报道的大肠杆菌复制体进行滚环复制的结果一致，表明新构建的模板在支持 DNA 复制方面表现稳定且高效。
研究结论和讨论
综上所述，研究人员成功开发出一种简便、可定制且高效的策略来生成滚环 DNA 底物，能够直接控制缺口大小和叉位置。该方法在成本和时间要求上与现有方法相当，但却具有独特的优势。例如，通过控制缺口大小，可以为不同的复制体创造最佳的组装条件，就像为不同的运动员准备合适的比赛场地。控制叉位置则可以在叉与感兴趣的遗传元件（如转录启动子或特定的 DNA 损伤位点）之间提供空间分离，有助于研究复制体在遇到诸如 DNA 二级结构、结合在 DNA 上的蛋白质和损伤等障碍物时的行为，还能有针对性地避开或靶向具有高二级结构的区域。尽管已知二级结构会影响 nCas9 的切割效率，但已有方法可以克服这些问题。因此，这项研究成果为研究复制蛋白在日益复杂和拥挤的 DNA 底物上的动力学提供了有力的工具，有望推动滚环 DNA 复制相关领域的进一步发展，让我们对微观世界里的 DNA 复制机制有更深入、更全面的认识。
