血液 RNA 测序在罕见病诊断中的比较研究：有无候选变异病例的差异分析

约 60% 罕见病经外显子 / 基因组测序（ES/GS）仍未确诊。本研究针对 128 例 ES/GS 未确诊患者，分析血液 RNA 测序（RNA-seq）对含 / 不含候选变异病例的诊断价值，发现其对剪接 VUS 诊断提升显著，无候选变异病例提升有限，支持 RNA 互补策略用于临床。

　　

在罕见病的诊疗领域，精准的病因诊断一直是临床难题。尽管外显子测序（ES）和基因组测序（GS）技术已广泛应用于寻找罕见病的分子病因，但仍有大约 60% 的病例在经过这些检测后仍无法明确诊断。这一诊断缺口主要源于两方面挑战：一是检测到的变异意义不明确（VUS），尤其是剪接相关变异难以仅凭 DNA 水平数据判断致病性；二是部分病例根本无法找到与表型匹配的候选变异。在此背景下，如何突破 DNA 检测的局限性，成为罕见病诊断领域亟待解决的问题。

为填补这一空白，上海交通大学医学院附属新华医院的研究人员开展了一项关于血液 RNA 测序（RNA-seq）在罕见病诊断中应用价值的研究。该研究成果发表在《Journal of Translational Medicine》上，通过系统分析 RNA-seq 在不同场景下的诊断效能，为优化罕见病诊断流程提供了关键证据。

研究人员采用了多队列研究设计，纳入 128 例曾接受 ES/GS 检测的疑似孟德尔遗传病患者，分为验证队列（7 例，已知 RNA 改变变异）和测试队列（121 例，ES/GS 未确诊）。测试队列进一步分为含剪接 VUS 的 10 例和无候选变异的 111 例。主要技术方法包括：①血液 RNA 提取与测序，使用 PAXgene 管采集血液样本，经 mRNA 文库构建后进行高通量测序；②数据处理与分析，通过 DROP 管道检测异常剪接（AS）和异常表达（AE）事件，结合 SpliceAI 预测评估剪接变异的致病性，并在无候选变异病例中通过 RNA 驱动策略筛选候选基因。

验证队列：分析流程的可靠性验证

在验证队列中，研究人员针对 3 例剪接变异和 4 例表达变异病例，通过设定 AS（|Δψ|≥0.2，padj<0.05）和 AE（p<0.05）阈值，成功检测到所有预期的 AS/AE 事件。例如，SON 基因的小插入缺失变异触发无义介导的 mRNA 降解（NMD），导致表达水平显著降低（p=4.37×10^-6）；16p13.11 缺失和 15q11.2 重复病例中，相关基因的表达水平变化与拷贝数变异完全吻合，验证了分析流程的准确性。

剪接 VUS 队列：RNA-seq 对变异解读的提升

在 10 例含剪接 VUS 的测试病例中，RNA-seq 显示 60%（6/10）的病例通过整合 RNA 数据实现了诊断提升。SpliceAI 预测与 RNA-seq 结果的完全吻合率仅为 40%，提示仅凭计算预测存在局限性。例如，CHD8 基因的 c.2730+4A>G 变异，RNA-seq 不仅检测到预期的外显子 13 跳跃，还发现内含子 12 保留，结合转录本比例和蛋白截短效应，该变异被重新分类为致病性（PVS1 (RNA)+PS2_Moderate+PM2_Supporting）。此外，研究发现 NMD 触发与表达水平变化的相关性较弱，约 72% 的 NMD 相关变异未伴随显著 AE，表明 AE 不能可靠反映 NMD 状态。

无候选变异队列：RNA 驱动策略的诊断潜力

在 111 例无候选变异的病例中，RNA-seq 实现了 2.7%（3/111）的诊断提升。3 例确诊病例均通过 AS 或 AE 事件锁定候选基因，例如 HGSNAT 基因的外显子 3-4 跳跃（Δψ=-0.57，p=2.86×10^-8）对应 4.3kb 缺失变异，因 ES 未能检测到该拷贝数变异（CNV）而漏诊；MBD5 基因的表达降低（FC=0.42，p=2.52×10^-10）提示启动子区域缺失。值得注意的是，在 RNA 驱动策略中，目标 AS/AE 事件在 16 例确诊病例中有 14 例排名前 8，但 2 例因缺乏 DNA 候选信息可能被漏诊。

研究结论与意义

本研究明确了血液 RNA-seq 在罕见病诊断中的双重角色：在含剪接 VUS 病例中，其通过精准刻画转录本异常，显著提升变异致病性分类的准确性，诊断提升率达 60%；而在无候选变异场景下，尽管 RNA 驱动策略可识别部分病例（2.7%），但其效能受限于血液基因表达谱和变异检测范围。研究结果支持将 RNA-seq 作为 ES/GS 的互补工具，尤其是在解读剪接相关 VUS 时具有不可替代的价值。此外，研究还提出了优化的诊断流程，建议在 ES/GS 后对含可疑剪接变异或表达异常的病例进行 RNA-seq 检测，以整合功能证据完善诊断。

该研究不仅为临床罕见病诊断提供了实证依据，也揭示了 RNA-seq 在克服 DNA 检测局限性中的独特优势。未来，结合组织特异性转录组分析和更优化的数据解读算法，RNA-seq 有望进一步提升罕见病的诊断率，推动精准医学在遗传病领域的应用。