基于CRISPR/Cas12a的无扩增检测技术在临床分离株中精准识别Guiana - Extended - Spectrum（GES）β - 内酰胺酶的应用研究

推荐 为解决因缺乏特定诊断测试导致Guiana - Extended - Spectrum（GES）β - 内酰胺酶可能被低估诊断的问题，研究人员开展了基于优化的无扩增CRISPR/Cas12a检测技术的研究。结果显示该检测对79个标准菌株灵敏度和特异性均达100%，对临床分离株检测时间小于1.5小时，有望成为临床微生物实验室常规诊断工具。

　　

论文解读
近年来，抗菌药物耐药性问题日益严峻，已成为全球健康和经济的重大威胁。其中，碳青霉烯酶产生菌更是主要威胁之一。Guiana - Extended - Spectrum（GES）β - 内酰胺酶作为次要A类碳青霉烯酶，由于其缺乏特定的诊断测试，其流行情况可能被低估。传统的基因型检测方法虽灵敏度高，但需要复杂的基础设施、专业人员和昂贵的设备，且基于PCR的技术存在一些问题，同时缺乏针对GES的特定诊断工具。因此，开发新的分子检测方法来填补罕见β - 内酰胺酶检测的空白迫在眉睫。

来自国外某研究机构的研究人员开展了基于优化的无扩增CRISPR/Cas12a检测技术对GES β - 内酰胺酶进行检测的研究。他们优化了CRISPR/Cas12a方法，采用多重crRNA策略、高效的DNA报告分子（TTATT - 5C）以及鼠源RNase抑制剂防止crRNA降解。通过对79个标准菌株的检测，该检测方法展现出100%的灵敏度和特异性，以及100%的阳性预测值和阴性预测值，检测时间小于1.5小时。此外，研究人员还确定了该检测在不同细菌中的检测限，在肠杆菌科中为1 ng/μL，在铜绿假单胞菌中为3 ng/μL，这种差异是由于bla<subGES基因的位置不同导致的，在铜绿假单胞菌中该基因位于染色体整合子中，仅存在一到三个拷贝，而在肠杆菌科中存在于多拷贝的质粒上。研究结果表明，该方法可成为临床微生物实验室的常规诊断工具，填补了GES β - 内酰胺酶商业诊断测试的空白。

研究背景方面，抗菌药物耐药性已成为全球关注的焦点，碳青霉烯酶产生菌是主要的耐药威胁之一。GES β - 内酰胺酶作为次要A类碳青霉烯酶，因其缺乏特定诊断测试，流行情况被低估。传统的检测方法存在诸多局限性，无法满足快速、准确检测的需求。因此，研究人员致力于开发一种新的分子检测方法来解决这一问题。

研究人员采用的关键技术方法包括优化的CRISPR/Cas12a检测技术，利用多重crRNA策略提高检测的准确性，选用高效的DNA报告分子（TTATT - 5C）增强荧光信号，同时使用鼠源RNase抑制剂防止crRNA降解。样本队列来源于79个标准菌株以及临床分离株。

研究结果方面，首先在检测灵敏度和特异性上，通过对79个标准菌株的检测，该CRISPR/Cas12a检测方法展现出100%的灵敏度和特异性，以及100%的阳性预测值和阴性预测值，检测时间小于1.5小时。其次，在检测限方面，该检测在肠杆菌科中的检测限为1 ng/μL，在铜绿假单胞菌中为3 ng/μL，这种差异与bla<subGES基因的位置有关，铜绿假单胞菌中该基因位于染色体整合子，拷贝数少，而肠杆菌科中存在于多拷贝质粒上。

研究结论和讨论部分强调了该方法的重要性。研究人员开发的方法通过优化的报告探针和多重crRNA CRISPR/Cas12a系统，实现了对GES β - 内酰胺酶的精准检测，具有重要的临床应用价值。该方法无需预扩增步骤，减少了交叉污染的风险，缩短了检测时间，有望成为临床微生物实验室的常规诊断工具。同时，研究结果也揭示了bla<subGES基因在不同细菌中的不同基因组背景，为进一步研究GES β - 内酰胺酶的传播和耐药机制提供了依据。该研究为解决抗菌药物耐药性问题提供了新的技术手段，具有重要的现实意义。论文发表在《International Journal of Antimicrobial Agents》上。