基于电渗流纳米注射技术的绿色微藻基因递送新方法

《Marine Biotechnology》：Electroosmotic Flow-Based Nanoinjection Technique Using a Nanopipette for Green Microalgae

为解决微藻基因修饰效率低下的难题，东京农业大学与横河电机合作开发了基于电渗流的纳米注射技术。该研究利用30 nm纳米移液管，在Haematococcus sp.和Tetraselmis sp.中实现FITC-葡聚糖(70 kDa)的精准递送，注射效率达44-45%，为微藻代谢工程提供了突破性的单细胞操作平台。

微藻作为光合固碳和生物合成的明星宿主，其应用潜力被细胞壁这道"分子城墙"严重制约。传统基因递送方法如基因枪轰击和电穿孔效率不足1.8×10⁴转化体/μg-DNA，远低于大肠杆菌的8.7×10⁸。东京农业大学与横河电机组成的跨学科团队在《Marine Biotechnology》发表突破性成果，通过电渗流驱动的纳米移液管技术，首次实现对细胞壁完整微藻的精准注射，为微藻合成生物学开辟了新维度。

研究采用单细胞操作平台Single Cellome^TM SU10，结合30 nm石英纳米移液管，通过实时离子电流监测实现细胞表面自动定位。以Haematococcus sp. NKG7001和Tetraselmis sp. NKG400013为模型，优化电压(5-6 V)和注射时间(0.1-1 s)等关键参数，通过FITC-葡聚糖示踪评估递送效率。

监测离子电流揭示细胞壁影响
纳米注射过程中，微藻细胞呈现独特的电流波动模式（图3a-c），与哺乳细胞HEK293T的稳定信号（图3d-f）形成鲜明对比。这种差异源于微藻复杂的亚细胞结构，当纳米移液管接触叶绿体等细胞器时，离子迁移受阻导致信号震荡。

细胞形态决定注射成功率
针对Haematococcus sp.四阶段生命周期（图5）的研究显示，鞭毛细胞(21%)和胶群体(6%)可成功注射，而随着细胞壁增厚，中间体和孢囊阶段完全无法穿透（表1）。荧光成像显示FITC-葡聚糖主要定位于叶绿体周边狭窄的胞质区（图4a-c），与哺乳细胞均匀分布（图4d-f）形成有趣对比。

参数优化实现高效递送
通过系统优化，Haematococcus sp.在6V/1s条件下达44%效率（表2），Tetraselmis sp.在5V/1s时效率45%（表3）。值得注意的是，57%的注射细胞可正常分裂，证实该方法对细胞活性影响极小。

该研究开创性地将纳米注射技术拓展至微藻领域，其单细胞精度和飞升级定量控制能力远超传统方法。Tsuyoshi Tanaka团队提出的自动化方案（图1a）每分钟可完成1次注射，单根纳米移液管可连续操作50次。

这种与细菌接合类似的物理穿透策略，为CRISPR-Cas9 RNP等大分子递送提供了新思路。未来结合自动细胞识别系统，该技术有望成为微藻合成生物学的标准操作平台，加速从固碳减排到高值化合物生产的全链条创新。