《Poultry Science》：Exosomes derived from avian influenza virus-infected chickens modulate host immune responses
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本研究针对禽流感病毒(AIV)感染过程中外泌体介导的免疫调节机制尚不明确的问题，开展了低致病性(LPAIV)和高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染鸡血清来源外泌体的免疫调控功能研究。通过体内外实验证实AIV来源外泌体可携带病毒RNA和核蛋白(NP)/非结构蛋白1(NS1)，在脾脏引发强烈免疫反应（HPAIV-EXO诱导抗病毒细胞因子，LPAIV-EXO上调抗炎因子），在巨噬细胞中LPAIV-EXO通过高效递送病毒蛋白激活更强免疫应答。该研究为外泌体疫苗开发提供了新思路。
禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）一直是全球家禽养殖业和公共卫生领域的重大威胁。根据血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶的抗原性，AIV可分为不同亚型，其中H5、H7和H9是最常在野生鸟类中检测到的HA亚型。这些病毒中的H5和H7亚型通常表现为低致病性禽流感病毒（Low Pathogenic Avian Influenza Virus, LPAIV），感染后仅出现轻微或无症状，但它们可能突变为高致病性禽流感病毒（Highly Pathogenic Avian Influenza Virus, HPAIV），导致鸡形目鸟类出现严重疾病和高死亡率。此外，AIV疫情已造成毁灭性的家禽损失，并有报道显示病毒可感染非鸟类物种，包括猪、奶牛和人类，凸显了针对这种人畜共患疾病采取严格控制措施的必要性。
在这一背景下，外泌体（exosomes）作为宿主-病原体相互作用的关键介质日益受到关注。外泌体是直径30-200纳米的膜结合囊泡，由所有细胞类型释放，能在细胞间运输蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等生物分子。它们作为细胞间通讯的重要载体，在健康和疾病状态中发挥调节作用。特别值得注意的是，病毒感染的细胞所释放的外泌体可以携带病毒蛋白和RNA至受体细胞，从而可能显著影响免疫反应。例如，之前的研究表明，源自HPAIV H5N1感染鸡的外泌体可通过激活I型干扰素、促炎细胞因子和免疫信号通路，在多种鸡免疫细胞（包括巨噬细胞、成纤维细胞以及T和B细胞系）中引发抗病毒反应。然而，这些发现目前仅限于体外分析，外泌体在体内的功能机制仍不清楚。
为了解决这一知识空白，本研究旨在评估来自LPAIV和HPAIV感染鸡的血清源性外泌体的免疫调节潜力。研究人员将这类外泌体（分为未感染对照CTRL-EXO、LPAIV感染来源LPAIV-EXO和HPAIV感染来源HPAIV-EXO）通过肌肉注射方式接种到未接触过病毒的雏鸡体内，并收集组织和血清样本。通过反转录定量聚合酶链反应（Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）定量检测免疫相关组织（肺、脾脏和气管）中细胞因子基因的表达，以评估免疫反应。同时，这些外泌体也被应用于鸡巨噬细胞HD11细胞系，通过RT-qPCR确定细胞摄取情况和细胞因子表达，并利用免疫细胞化学技术检测外泌体递送的病毒核蛋白（Nucleoprotein, NP）和非结构蛋白1（Nonstructural Protein 1, NS1）在HD11细胞中的存在。
本研究主要应用了以下关键技术方法：首先，从感染和未感染鸡血清中分离并鉴定了外泌体（CTRL-EXO、LPAIV-EXO、HPAIV-EXO），并通过Western blot检测病毒NP和NS1蛋白；其次，通过体内实验将外泌体注射至雏鸡，采集脾脏、肺和气管组织，利用RT-qPCR分析细胞因子表达；此外，在体外使用鸡巨噬细胞HD11细胞系，通过DiI标记示踪外泌体摄取，并采用RT-qPCR和免疫细胞化学分别评估细胞因子表达及病毒蛋白递送情况。所有动物实验均遵循世界动物卫生组织指南，并在越南国家兽医研究所的生物安全2级增强设施中进行。
检测外泌体中的病毒组分
通过PCR和Western blot分析，研究人员在来自LPAIV-EXO和HPAIV-EXO鸡血清的外泌体中检测到了H5 AIV RNA和流感病毒NP蛋白。结果显示，LPAIV-EXO表现出清晰的NP条带，而HPAIV-EXO的条带较弱。NS1蛋白在相同条件下未获得可靠结果。这些发现表明，AIV感染来源的外泌体确实携带病毒遗传物质和蛋白成分，提示外泌体可能作为病毒感染的媒介参与免疫调节。
通过AIV外泌体注射在鸡组织中诱导的免疫反应
在体内实验中，研究人员将外泌体注射到未接触病毒的鸡体内，并检测了肺、脾脏和气管中细胞因子的表达。结果显示，脾脏在注射外泌体后表现出最强的免疫反应，与AIV外泌体组中抗病毒细胞因子和干扰素的升高相关。具体而言，HPAIV-EXO显著上调了IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子和干扰素，而LPAIV-EXO则主要上调抗炎细胞因子IL-4和IL-10。与脾脏相比，肺和气管的免疫反应较弱，表明外泌体介导的免疫调节具有组织特异性，且脾脏作为富含免疫细胞的淋巴器官，对循环外泌体的识别和反应更为强烈。
鸡免疫细胞系对AIV外泌体的细胞摄取
为验证外泌体是否能够被免疫细胞摄取，研究人员用DiI标记的CTRL-EXO、LPAIV-EXO和HPAIV-EXO处理HD11巨噬细胞。荧光成像显示，所有外泌体均能被细胞内化，主要定位于细胞质中，证实了外泌体可被巨噬细胞有效摄取，为后续免疫反应研究奠定了基础。
用AIV外泌体处理的HD11巨噬细胞诱导细胞因子表达
在体外实验中，HD11细胞经50微克/毫升外泌体处理4小时后，通过RT-qPCR测量了I型干扰素（IFN-α、IFN-β）、II型干扰素（IFN-γ）、促炎细胞因子（IL-1β、IL-18、TNF-α）、抗炎细胞因子（IL-4）和趋化因子IL-8的mRNA水平。结果显示，LPAIV-EXO处理组的细胞因子表达最高，显著高于CTRL-EXO和HPAIV-EXO组，表明LPAIV来源的外泌体在巨噬细胞中诱导了更强的免疫激活。
病毒蛋白通过AIV外泌体在鸡巨噬细胞系中的递送
通过免疫细胞化学技术，研究人员进一步证实了外泌体可将病毒蛋白递送至宿主细胞。NP和NS1在LPAIV-EXO处理的HD11细胞中信号更强，其中NP在细胞质中表达，而NS1主要定位于细胞核。这一结果与Western blot数据一致，说明LPAIV-EXO携带的病毒蛋白更多，可能与其更强的免疫刺激效应相关。
综合讨论与结论部分，本研究通过体内外实验证实，禽流感病毒来源的外泌体可作为病毒组分（如H5 RNA、NP和NS1蛋白）的载体，在宿主中调控免疫反应。研究发现外泌体的免疫调节效应具有组织特异性和病毒致病力依赖性：HPAIV-EXO在脾脏中引发强烈的促炎和抗病毒反应，而LPAIV-EXO在巨噬细胞中诱导更显著的细胞因子表达。这些差异可能与外泌体内病毒蛋白（如NP和NS1）的含量以及宿主免疫环境的差异有关。NP作为病毒复制必需的结构蛋白，可能通过激活TLR4和NLRP3炎症小体途径促进促炎细胞因子产生；而NS1作为免疫逃避蛋白，在外泌体中可能以核定位方式调节宿主抗病毒反应。此外，外泌体携带的病毒RNA和非编码RNA（如miRNA）也可能通过模式识别受体（如TLR）途径参与免疫激活。
本研究的重要意义在于首次在鸡体内模型中系统揭示了AIV感染来源外泌体的免疫调节功能，证实了这类外泌体可在无直接病毒感染的情况下独立诱导免疫反应。这不仅深化了对病毒-宿主相互作用机制的理解，也为开发基于外泌体的诊断工具、疫苗候选物及免疫调节策略提供了理论依据。未来研究需进一步阐明外泌体货物如何与先天免疫受体互作，以及其在病毒传播和致病性中的具体角色。该论文发表于《Poultry Science》，为禽流感防控和外泌体应用研究开辟了新方向。
