《International Journal of Pharmaceutics》：Vitamin A-spermine conjugated lipid nanoparticles for efficient nucleic acid delivery in ocular and hepatocellular cells
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维生素A与精胺共价修饰构建新型脂质纳米颗粒（VA-6C-Sper/DOPE），通过视黄醇结合蛋白受体（RBP/STRA6）实现肝细胞癌（HepG2）和视网膜色素上皮细胞（ARPE19）的高效靶向递送siRNA及质粒，细胞摄取和基因调控效果显著优于Lipofectamine，为维生素A代谢相关眼部疾病治疗提供新载体。
Jinliang Ye|Xinli Fan|Yizhi Man|Zhen Zhang|Qian Wang|Jing Wang|Xinjing Tang
北京大学药学院天然与仿生药物国家重点实验室，中国北京学院路38号，邮编100191
摘要
脂质纳米颗粒（LNPs）目前是临床批准的核酸药物的主要递送策略。然而，其固有的靶向限制、较低的溶酶体逃逸效率以及潜在的免疫原性风险对LNP技术的广泛应用构成了重大挑战。维生素A和精胺是内源性小分子，均显示出低毒性和高效药物递送的潜力。在本研究中，我们通过将维生素A与精胺结合，制备了一系列新型脂质VA-linker-Sper。利用辅助脂质二油酰磷脂乙醇胺（DOPE），我们成功开发了一种核酸递送试剂VA-6C-Sper/DOPE。该试剂通过维生素A受体介导，在肝细胞癌细胞（HepG2）和视网膜色素上皮细胞（ARPE19）中实现了siRNA和质粒的高效递送。VA-6C-Sper的细胞摄取和基因调控效果远优于商业转染试剂Lipofectamine。
引言
功能性核酸药物通过碱基特异性配对机制在基因表达调控方面表现出显著的优势，并在疾病治疗中具有巨大潜力。近年来，脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种高效的药物递送系统，在核酸药物递送和基因治疗领域取得了显著进展（Mehta等人，2023年；Hald Albertsen等人，2022年；Alshehry等人，2025年；Cullis和Felgner，2024年）。目前，LNPs是大多数获批核酸药物和临床试验的主要递送方法（Thi等人，2021年；Cheng等人，2024年）。然而，它们的潜在免疫原性、生物毒性和相对较低的递送效率仍然是一个重要挑战。因此，开发安全高效的递送载体对于核酸药物的发展仍然十分迫切。
LNPs通常由阳离子/可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和PEG化脂质组成。可电离脂质和辅助脂质能够有效封装遗传物质，促进细胞内化过程并增强内体逃逸。通过优化脂质组成和配方，可以调整LNPs的物理化学性质以满足不同的递送需求（Sun和Lu，2023年；Alvarez-Benedicto等人，2022年；Eygeris等人，2022年）。Xu等人通过将1,2-二油酰-3-三甲铵丙烷（DOTAP）、二十八烷基二甲基溴化铵（DDAB）或EPC等阳离子脂质引入传统脂质纳米颗粒配方中，实现了mRNA的肺靶向递送（Su等人，2024年）；添加阴离子脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（18PA）则实现了脾脏靶向（Song等人，2024年）。还有研究开发了一种源自神经递质的脂质，使携带基因编辑蛋白的脂质纳米颗粒能够穿透血脑屏障并进入小鼠大脑，实现高效递送（Ma等人，2020年）。Hunter等人开发了一种新型可电离脂质L828，通过与抗CD5抗体结合，创建了一种非肝靶向的tLNP配方，实现了对脾脏中CD8+免疫细胞的CAR mRNA特异性递送（Hunter等人，2025年）。
LNP技术的有效性高度依赖于阳离子或可电离脂质与核酸之间的相互作用（Eygeris等人，2022年；Mukai等人，2022年）。精胺是一种寡胺化合物，在哺乳动物细胞中广泛存在，具有优异的生物相容性和对核酸的高亲和力。在生理条件下，精胺带有强正电荷，能够结合核酸、蛋白质和生物膜等负电荷成分，在核酸和蛋白质合成、基因表达及蛋白质折叠中起重要作用（Igarashi和Kashiwagi，2010年）。此外，它还参与减少氧化损伤、调节离子通道以及维持细胞内的超分子结构（Pegg，2014年；Sagar等人，2021年）。J. Viola等人将精胺与不同长度的脂肪酸链结合，实现了质粒DNA的有效递送（Viola等人，2009年）。Tang等人将维生素E修饰的精胺与siRNA和DSPE-PEG2000复合物结合，自组装成脂质纳米颗粒，实现了siRNA的高效递送和释放，并在小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤效果（Zhao等人，2024年）。
维生素A是一类亲脂性化合物，广泛参与人体生理活动，包括活性形式视黄醇、视黄醛棕榈酸酯和β-胡萝卜素。它对维持正常人体功能（如视觉神经发育、细胞生长和代谢、免疫及生殖发育）至关重要（Menezes和Almeida，2024年）。血液中的视黄醇可以与视黄醇结合蛋白（RBP）结合，然后通过位于视网膜色素上皮（RPE）细胞表面的RBP受体STRA6进入细胞（Steinhoff等人，2022年；Kawaguchi等人，2015年；Amengual等人，2014年）。通过RBP-STRA6系统的运输和摄取，确保了RPE细胞持续获得视黄醇，支持视觉循环以及视觉神经细胞的更新和修复（von Lintig等人，2024年）。此外，Xu等人开发了一种维生素A修饰的分支聚氨基糖苷阳离子基因递送载体（SS-HPVA），靶向肝星形细胞递送质粒shRNA-TGFβ1，实现了对肝纤维化相关基因的抑制并逆转了肝纤维化（Tong等人，2023年）。Huang等人利用具有负电荷特性的维生素A核心-壳交联纳米复合物（T-C-siRNA），实现了对HSC细胞的靶向递送，并沉默了Toll样受体4（TLR4）基因（Huang等人，2023年）。
在这里，维生素A通过烷基连接器和酰胺键与亲水性精胺分子共价结合，生成了一种名为VA-6C-Sper的新脂质。辅助脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）被加入以形成VA-6C-Sper/DOPE递送剂。我们在肝细胞癌细胞（HepG2）和视网膜色素上皮细胞（ARPE19）中测试了VA-6C-Sper/DOPE复合物与质粒DNA和siRNA的转染效率。我们将系统地表征VA-6C-Sper/DOPE平台，包括其物理化学性质和细胞毒性，然后量化其细胞摄取和基因调控能力，以探索其有效的安全核酸药物递送载体。
材料
维生素A醋酸酯购自中国北京的Fuyuan公司，精胺购自中国上海的Bidepharm公司。1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基丁二酰胺（NHS）购自中国上海的Sane Chemical Technology公司。Hoechst 33,342和LysoTracker Deep Red购自美国Thermo Fisher Scientific公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）购自中国北京的Solarbio公司。
维生素A-6C-精胺的合成与表征
如图1所示，以维生素A醋酸酯为起始原料，在氢氧化钠存在下水解生成维生素A，随后将其与过量的己二酸反应，得到VA-6C-COOH。VA-6C-COOH的酸基团通过NHS和EDCI活化，生成VA-6C-NHS。VA-6C-NHS再与过量的精胺反应，得到VA-6C-Sper。反应完成后加入乙酸乙酯。
结论与讨论
维生素A和精胺都是天然存在的生物活性小分子，在核酸递送和LNP脂质成分优化方面发挥了重要作用。在本研究中，我们通过烷基连接器将维生素A与精胺通过可降解的酯键结合，合成了维生素A-精胺衍生物VA-6C-Sper。然后将其与siRNA物理混合并自组装成纳米复合物（VA-6C-Sper/siRNA）。
CRediT作者贡献声明
Jinliang Ye：可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。Xinli Fan：撰写——初稿、可视化、监督、资金获取、概念化。Yizhi Man：方法学、研究。Zhen Zhang：数据管理。Qian Wang：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。Jing Wang：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。Xinjing Tang：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、资金支持
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢北京大学健康科学医学与健康分析中心在纳米颗粒电子显微镜图像方面的协助。本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22207006和22277003）和国家重点研发计划（项目编号：2022YFC2303703）的财政支持。
