《Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports》：Validation and field evaluation of a double-antigen sandwich ELISA for the detection of antibodies against
Anaplasma spp. in individual and bulk tank milk samples in dairy cattle
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牛环形斑.bit帕拉烯丝虫病（Anaplasma marginale）的检测方法研究。通过双抗原夹心ELISA（dasELISA）检测个体牛奶和牛群牛奶样本，验证其诊断性能，并与nested PCR结果对比，发现敏感度96.5%，特异度86.0%。评估发现血清与牛奶检测结果一致性85.7%，κ值0.71。在阿根廷主要奶牛区检测3049份牛群牛奶样本，发现带虫率随纬度升高而下降，与传播媒介Rhipicephalus microplus分布相关。dasELISA适用于个体牛奶抗体检测和牛群感染监测。
朱利奥·贝莱泽（Julio Bellezze）|马塞洛·马丁内斯·佩里亚（Marcelo Martínez Pería）|卡罗琳娜·索莱达德·汤普森（Carolina Soledad Thompson）|苏珊娜·托里奥尼·德·埃查伊德（Susana Torioni de Echaide）|维克托·范齐尼（Victor Vanzini）|伊格纳西奥·爱德华多·埃查伊德（Ignacio Eduardo Echaide）|玛丽亚·埃万杰利娜·普里莫（María Evangelina Primo）
银河系研究所（IdICaL）（INTA-CONICET），阿根廷圣菲省拉斐拉市34号公路227公里处
摘要
牛无形体病是一种由红细胞内寄生细菌Anaplasma marginale引起的全球性传染病，该细菌通过蜱虫和污染物传播。本研究的目的是验证一种双抗原夹心ELISA（dasELISA）方法，用于检测个体牛奶样本和批量牛奶（BTM）中的Anaplasma抗体，以作为筛查工具。使用来自A. marginale感染（n = 29头）和未感染（n = 100头）奶牛的个体样本（牛奶、全血和血清），并通过嵌套PCR作为参考标准技术，验证了该ELISA方法检测牛奶中Anaplasma抗体的有效性。同时，还使用了76头接种了A. centrale疫苗的奶牛的类似样本来评估交叉反应性。通过分析293头奶牛的配对样本，评估了血清和牛奶检测结果的一致性。在低流行区域的114个奶牛群中，评估了dasELISA在批量牛奶样本上的性能。通过血清学和分子技术对每个奶牛群中的29-30头奶牛进行检测，确定了该奶牛群的Anaplasma感染状态。最后，分析了3,049份批量牛奶样本，以评估阿根廷主要奶牛区（位于南纬28至34度之间）中感染Anaplasma的奶牛群的比例（PDHI）。在个体牛奶样本中，dasELISA的临界值为阳性率≥3%（%P），诊断敏感性（DSe）为96.5%（95%置信区间，82.2–99.9），诊断特异性（DSp）为86.0%（95%置信区间，77.6–92.1）。牛奶和血清检测结果之间的一致性为85.7%，κ值为0.71（95%置信区间=0.63–0.78）。在已知感染状态的奶牛群中，当临界值≥3%P时，dasELISA在批量牛奶样本中的诊断敏感性为89.5%，特异性为95.6%。当nPCR确认奶牛群感染A. marginale时，dasELISA能够检测出所有这些奶牛群。在实地研究中，20%的批量牛奶样本检测结果呈阳性。随着纬度的升高，PDHI率下降，这与该地区A. marginale的流行情况及其主要传播媒介Rhipicephalus microplus的存在/缺失有关。在通常进行疫苗接种的奶牛群中，如果同时感染A. centrale，PDHI率可能会被高估。dasELISA可用于检测个体牛奶样本中的Anaplasma抗体，并用于批量牛奶样本的流行病学监测。
引言
牛无形体病是一种由专性红细胞内寄生细菌Anaplasma marginale（立克次体目；无形体科）引起的传染病（Theiler, 1910）；它是牛最常见的蜱传病原体之一（Palmer et al., 2000）。Anaplasma marginale通过蜱虫从感染牛传播给易感牛，或通过叮咬蝇类和污染物机械传播，在世界热带和亚热带地区呈地方性流行（Kocan et al., 2010）。在阿根廷，A. marginale主要分布在南纬33度以北地区，其生物传播媒介Rhipicephalus microplus的分布范围则更北（Nava et al., 2022）。然而，由于携带牛迁移到非流行区，南部流行区也出现了无形体病暴发（Primo et al., 2021）。急性无形体病主要影响成年牛，其特征是严重贫血、体重下降、产奶量减少以及频繁死亡（Aubry and Geale, 2011; Kocan et al., 2010）。从急性疾病中恢复的牛仍为A. marginale的携带者，并继续向其他动物传播（Eriks et al., 1993）。在阿根廷及全球多个地区，犊牛会接种活A. centrale疫苗，以防止流行区奶牛群的无形体病暴发（当自然免疫无效时）。该疫苗不能预防A. marginale感染，但可以减轻疾病严重程度并防止死亡（Abdala et al., 1990）。
在无无形体病的奶牛群中，防止携带牛进入或及早发现它们对于预防疫情爆发和避免相关经济损失至关重要。Anaplasma携带者的红细胞寄生率（PE）在10^2至10^7 PE/mL之间波动，这种水平通常无法通过直接显微镜检测到（Eriks et al., 1989）。高灵敏度的分子技术，如嵌套聚合酶链反应（nPCR）和实时PCR，能够在低至30 PE/mL（约10^-6%立克次体血症）的浓度下检测到寄生虫（Carelli et al., 2007; Primo et al., 2022; Torioni de Echaide et al., 1998; WOAH Terrestrial Manual, 2024）。尽管这些方法被推荐用于识别携带者，但由于成本和复杂性，它们不适合大规模检测，也不适用于发展中国家。因此，通常通过检测针对Anaplasma的抗体的存在来诊断感染。虽然已经开发了多种血清学检测方法，但酶联免疫吸附测定（ELISA）是全球最广泛使用的方法（Aubry and Geale, 2011; WOAH Terrestrial Manual, 2024）。基于A. marginale重组主要表面蛋白5（rMSP5）的间接ELISA（iELISA）（Morzaria et al., 1999）、竞争性ELISA（cELISA）（Knowles et al., 1996）和双抗原夹心ELISA（dasELISA）（Sarli et al., 2020）也被开发并验证用于检测Anaplasma抗体。这些ELISA也能检测到由A. centrale产生的抗体（Molloy et al., 1999）。最近开发的ddasELISA和cELISA-sAm能够特异性检测针对A. marginale的抗体（Bellezze et al., 2023; Bellezze et al., 2025）。所有这些ELISA均以血浆或血清作为样本基质。
牛奶是适合用ELISA检测抗体的样本。由于牛奶样本无创且采集成本低于血清和血浆样本，因此它们被广泛用于针对个体动物或批量牛奶（BTM）的群体免疫状态检测（Palmer et al., 2000; Pautienius et al., 2021）。本研究的目的是验证dasELISA在个体牛奶样本中检测Anaplasma抗体的有效性，作为血清样本的替代方法，并用于批量牛奶样本的群体监测和感染检测。为此，使用特征明确的奶牛的个体牛奶样本建立了dasELISA的临界值，并通过现场试验将其性能与血清样本的结果进行了比较。随后，使用感染或未感染Anaplasma的奶牛群的批量牛奶样本评估了dasELISA的性能（感染状态通过血清学和分子技术确定）。最后，使用批量牛奶样本评估了阿根廷主要奶牛区感染Anaplasma的奶牛群的比例（PDHI）。
伦理批准
所有实验均按照农业研究和教学中对农业动物的护理和使用指南（动物科学协会联合会，2010）进行，并得到了阿根廷利托拉尔国立大学兽医学院动物护理委员会的批准（CAES协议728/22）。
个体牛奶和血液样本
从位于R. microplus无蜱区的3个奶牛群中收集了个体牛奶、全血和血清样本
在个体牛奶样本上验证dasELISA
使用129份具有明确感染状态的奶牛样本（H1和H2组）确定，在牛奶样本中检测Anaplasma抗体的最佳临界值为阳性率≥3%（DSe = 96.5%（95%置信区间=82.2–99.9%），DSp = 86.0%（95%置信区间=77.6–92.1%）。与nPCR-RFLP相比，AUC值为0.971（95%置信区间0.926–0.993，p<0.001），具有很高的准确性（图2）。有15份样本的dasELISA和nPCR-RFLP检测结果不一致，但其中7份样本的结果一致
讨论
批量牛奶样本的分析已被纳入全球奶牛疾病监测计划（Houe et al., 2006; Nuotio et al., 2003），其有效性取决于所使用检测方法的特性、疾病的流行程度以及奶牛群的大小。识别携带宿主对于管理如A. marginale引起的持续感染至关重要（Eriks et al., 1993）。在本研究中，验证了一种用于
结论
个体牛奶和批量牛奶样本均适合用dasELISA检测Anaplasma抗体，表现出非常好的性能。此外，个体牛奶和血清检测结果之间具有很好的一致性。在批量牛奶样本上检测时，dasELISA能够识别出所有通过血清学和nPCR-RFLP确认感染A. marginale的奶牛群。实地研究表明，PDHI率随纬度的升高而下降，这与R. microplus的存在/缺失有关
CRediT作者贡献声明
朱利奥·贝莱泽（Julio Bellezze）：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析。马塞洛·马丁内斯·佩里亚（Marcelo Martínez Pería）：撰写——审稿与编辑、方法学、概念化。卡罗琳娜·索莱达德·汤普森（Carolina Soledad Thompson）：撰写——审稿与编辑、方法学、概念化。维克托·范齐尼（Victor Vanzini）：撰写——审稿与编辑、研究、概念化。伊格纳西奥·爱德华多·埃查伊德（Ignacio Eduardo Echaide）：撰写——审稿与编辑、研究、概念化。玛丽亚·埃万杰利娜·普里莫（María Evangelina Primo）：撰写——审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明没有财务利益冲突。
作者保证，参与本研究的所有程序均符合国际生物医学研究动物伦理指南的标准，并得到了阿根廷利托拉尔国立大学兽医学院动物护理委员会的批准（CAES协议728/22）。
致谢
我们感谢Paola Amhertd在dasELISA和nPCR-RFLP检测中的技术支持，以及Agric. Ing. Mónica Moretto在调查期间的宝贵合作与协助。本研究得到了INTA、INTA Rafaela合作协会（TCP #426100）、CONICET圣菲科学技术创新机构（IO-2019-130）和国家科学技术促进机构（PICT2019-01498）的支持。
