《Insects》：Genomic Insights and Bioconversion Potential in the Black Soldier Fly (Hermetia illucens): Current Advances and Future Directions
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本文通过?Ct法、geNorm、NormFinder和BestKeeper四种算法，系统评估了18S rRNA、ACTIN、TUB等9个内参基因在二化螟不同发育阶段（三龄幼虫、五龄幼虫、雌雄蛹、雌雄成虫）于干旱或复水胁迫下的表达稳定性。研究发现最优内参基因具有发育阶段特异性，且双内参基因组合可显著提高qRT-PCR数据的可靠性，为昆虫湿度应激分子机制研究提供了标准化工具。
引言
水分平衡调节是所有生物体内稳态的核心组成部分。对于昆虫而言，水分在代谢物运输、大分子结构维持以及时空分布变异决定中起着关键作用。然而，由于体型较小且表面积与体积比率较高，昆虫在维持水分平衡方面面临显著挑战。因此，昆虫进化出许多策略来管理水分，例如具有丰富疏水性表皮脂质的体壁、驯化处理以及调节水渗透性的蛋白质。随着全球气候变化，极端温度、降雨模式改变和干旱等环境条件将频繁发生。了解昆虫对水分可用性的响应非常重要，因为它对其生存、分布模式和物种丰富度具有显著影响。尽管如此，昆虫再水化和干燥抵抗的分子机制仍然知之甚少。
二化螟是一种重要的水稻和水生燕麦害虫，广泛分布于温带和亚热带亚洲、南欧和北非。在中国，二化螟的一龄至六龄幼虫钻入水稻和水生燕麦的茎秆，是该害虫对作物造成损害的主要阶段。二化螟造成的危害已蔓延至中国十多个省份，并逐渐加剧。幼虫喜欢干燥环境化蛹，而蛹偏爱高湿度条件，但不耐涝。几天后，蛹羽化为成虫，在寄主植物上产卵。二化螟的所有发育阶段都喜欢高湿度环境。在二化螟的防治中，常利用湿度来调节其危害。为了改善二化螟的绿色防控，阐明其在不同发育阶段对干燥或复水胁迫响应的分子机制至关重要。
更精确的二化螟基因组和更多转录组数据现已可用。基因表达分析对于识别不同生物体中各种基因的功能非常重要。实时荧光定量PCR是一种高可靠性、高灵敏度和高操作性的技术，可用于测量和评估功能基因表达。尽管qRT-PCR通常被描述为基因表达分析的金标准，但结果的可靠性直接受到某些因素的影响，例如RNA质量和数量、逆转录效率和引物设计。因此，使用适当的内参基因进行准确的基因表达标准化对于获得可靠的基因表达水平至关重要。内参基因，通常称为看家基因，基于其假定的组成型表达，例如ACTIN、18S核糖体RNA和微管蛋白。然而，值得注意的是，这些基因受到不同处理条件的影响，并且不存在通用的内参基因。此外，用于标准化的内参基因数量也会影响qRT-PCR的结果。因此，为了确保结果准确，必须针对特定实验验证内参基因。
在本研究中，评估了九个候选内参基因在干燥或复水条件下二化螟不同发育阶段的表达稳定性，包括18S rRNA、ACTIN、TUB、延伸因子1、泛素结合酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、组蛋白3、精氨酸激酶和核糖体蛋白S11。为了进一步评估结果，分析了热休克蛋白60基因的表达谱。本研究结果可为未来研究这种重要害虫物种的水分适应相关基因提供支持。
材料与方法
昆虫
二化螟采集自扬州稻田，并在环境培养箱中使用人工食料饲养，温度28 ± 1 °C，光周期16:8，相对湿度70 ± 5%。
不同湿度处理下的样品收集
根据初步实验，将五龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成虫和雌成虫暴露于25%、50%、75%和95%相对湿度下24小时。将三龄幼虫暴露于25%、50%、75%和95%相对湿度下各12小时。每个处理包括30头二化螟，存活的二化螟立即在液氮中冷冻并储存在-80 °C。
内参基因的选择
选择ACTIN、TUB、EF1、H3、RPS11、NADHD、AK、18S rRNA和UBI作为内参基因，并验证了其引物的特异性和扩增效率。
RNA提取与逆转录
使用SV总RNA分离系统从每个样品中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，然后通过分光光度法测量RNA纯度和浓度。然后，使用0.50 μg总RNA，使用Bio-Rad iScriptTM cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。
实时荧光定量PCR分析
将1:10稀释的cDNA用作qRT-PCR分析的模板。PCR反应混合物包含10 μL iTaq Universal SYBR Green supermix、1 μL每种基因特异性引物、2 μL cDNA模板和6 μL ddH2O。所有反应均在CFX-96实时PCR系统上进行。具体程序包括95 °C初始变性3分钟，随后在95 °C变性30秒，并在引物对的Tm值下退火/延伸30秒，共40个循环。进行从65 °C到95 °C的熔解曲线分析以确定扩增PCR产物的特异性。每个处理包括四个重复，每个重复进行三次技术重复。
统计分析
阈值循环值定义为荧光信号达到预设阈值所需的扩增循环数，该阈值在所有反应中设置为一致的荧光强度。使用?Ct法、BestKeeper、NormFinder版本0.953和GeNorm版本3.5评估9个候选内参基因的稳定性。?Ct法结果标准偏差较低表明基因更稳定。BestKeeper创建一个指数，较低的指数得分表明稳定性更高。NormFinder估计表达变异，其中较低值更稳定。geNorm算法计算表达稳定性值M并比较基因与其他基因的配对变异V。geNorm算法使用0.15作为截止值，Vn/Vn + 1比率超过0.15表明需要额外的内参基因。
内参基因的验证
选择二化螟中的Hsp60作为靶基因来验证稳定的内参基因。根据不同处理，根据2???Ct方法进行Hsp60的相对表达水平分析。使用75%相对湿度下的Hsp60表达作为校准对照。对于使用多个内参基因进行标准化，对每个内参基因单独进行标准化，然后对结果取平均值。使用SPSS v. 16.0进行单因素方差分析以进行比较。
结果
总RNA质量和PCR扩增特异性
通过qRT-PCR研究了二化螟不同发育阶段在干燥或复水条件下ACTIN、TUB、EF1、H3、RPS11、NADHD、AK、18S rRNA、UBI和Hsp60的表达水平。评估了从不同样品分离的总RNA的完整性、纯度和浓度。总RNA条带在琼脂糖凝胶电泳上完整，表明RNA完整性良好。A260/280比值证实所有RNA样品纯度较高。此外，所有十个基因产生的扩增子在熔解曲线分析中均呈现单峰，表明每个反应均扩增出独特产物。
内参基因的表达谱
表达水平表示为扩增达到固定阈值所需的循环数。绘制了不同实验条件下九个候选内参基因的Ct值。九个内参基因的平均Ct值范围从8.45到29.89。18S rRNA显示最丰富的表达水平，其次是RPS11、EF1、AK、H3、NADHD、UBI、TUB和ACTIN。然而，在三龄幼虫样品中，RPS11显示最小的Ct变异，而TUB显示最大的Ct变异；对于五龄幼虫，UBI显示最小的Ct变异，而AK显示最大的Ct变异。在雄蛹样品中，RPS11显示最小的Ct变异，而EF1显示最大的Ct变异；但对于雌蛹，18S rRNA显示最小的Ct变异，而NADHD显示最大的Ct变异。在雄成虫样品中，RPS11显示最小的Ct变异，而EF1显示最大的Ct变异；但对于雌成虫，RPS11显示最小的Ct变异，而18S rRNA显示最大的Ct变异。这些结果表明，没有单一的内参基因适用于标准化二化螟所有发育阶段在干燥或复水条件下的基因表达。
基因表达稳定性分析
对于三龄幼虫，在干燥或复水条件下，四种方法的综合分析发现18S rRNA和NADHD显示出最高的表达稳定性。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为18S rRNA > EF1 > H3 > UBI > NADHD > RPS11 > ACTIN > TUB > AK。比较?Ct法、NormFinder、Best Keeper和geNorm均显示TUB和AK是相对不稳定的内参基因。
对于五龄幼虫，在干燥或复水条件下，发现ACTIN和TUB显示出最高的表达稳定性。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为ACTIN > TUB > H3 > 18S rRNA > NADHD > RPS11 > AK > EF1 > UBI。NormFinder和geNorm均显示UBI是最不稳定的内参基因。
对于雄蛹，在干燥或复水条件下，四种方法的综合分析显示TUB和ACTIN最稳定。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为TUB > ACTIN > UBI > AK > H3 > RPS11 > 18S rRNA > EF1 > NADHD。NormFinder和geNorm均显示NADHD是最不稳定的内参基因。
对于雌蛹，在干燥或复水条件下，发现TUB、ACTIN和UBI显示出最高的表达稳定性。根据geNorm，稳定性排名从最稳定到最不稳定为UBI/ACTIN > TUB > AK > 18S rRNA > EF1 > H3 > RPS11 > NADHD。比较?Ct法、NormFinder、Best Keeper和geNorm均显示NADHD是最不稳定的内参基因。
对于雄成虫，在干燥或复水条件下，四种方法的综合分析发现UBI和H3显示出最高的表达稳定性。根据geNorm，稳定性排名从最稳定到最不稳定为RPS11/H3 > NADHD > ACTIN > UBI > TUB > 18S rRNA > AK > EF1。比较?Ct法、NormFinder、Best Keeper和geNorm均显示EF1是最不稳定的内参基因。
对于雌成虫，在干燥或复水条件下，发现EF1、RPS11和UBI显示出最高的表达稳定性。NormFinder分析显示稳定性排名为EF1 > NADHD > RPS11 > H3 > ACTIN > UBI > AK > TUB > 18S rRNA。比较?Ct法、NormFinder、Best Keeper和geNorm均显示18S rRNA是最不稳定的内参基因。
最佳内参基因数量
geNorm分析还确定了数据标准化所需的最佳内参基因数量。结果显示，在二化螟所有发育阶段于干燥或复水条件下，V2/3的配对变异值均低于0.15的截止值。这些结果表明，两个候选内参基因足以进行可靠的数据标准化。
用Hsp60验证内参基因
热休克蛋白60是一种普遍存在、高度丰富的分子伴侣，在生态适应中起着重要作用。比较了Hsp60在不同选定的内参基因下于干燥或复水条件下的相对表达。对于三龄幼虫的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：18S rRNA、AK以及两个推荐的内参基因。使用18S rRNA、AK和组合内参基因获得的Hsp60表达谱呈现出相似的趋势。
对于五龄幼虫，使用ACTIN、UBI和组合内参基因标准化Hsp60表达时检测到显著差异。
对于雄蛹和雌蛹的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：TUB、NADHD以及两个推荐的内参基因。在雄蛹中，Hsp60表达谱在TUB或组合内参基因与NADHD之间存在显著差异。在雌蛹中，当使用TUB或两个推荐的内参基因进行标准化时，Hsp60表达未被诱导。然而，当使用NADHD进行标准化时，Hsp60的表达谱发生显著变化。
对于雄成虫的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：UBI、EF1以及两个推荐的内参基因。Hsp60表达谱在组合内参基因与EF1之间存在显著差异。在雌成虫中，使用18S rRNA时Hsp60表达未被抑制。然而，当使用两个推荐的内参基因进行标准化时，Hsp60的表达谱被显著抑制。
讨论
qRT-PCR已成为检查基因表达水平的重要技术，因其具有特异性、准确性和可重复性。然而，qRT-PCR的准确性需要与内参基因进行稳健的标准化。广泛的研究表明，在所有实验环境下不存在单一的“通用”内参基因。在本研究中，调查了九个内参基因在二化螟不同发育阶段于干燥或复水条件下的表达水平。这些内参基因属于不同功能类别的蛋白质，以降低共调控的风险。我们的结果表明，?Ct法、NormFinder、BestKeeper和GeNorm在干燥或复水条件下对九个内参基因显示出不同的稳定性排名。尽管存在差异，但这四种方法的分析在不同实验条件下对最稳定和最不稳定内参基因的排名相似；例如，NADHD、EF1和18S rRNA在暴露于干燥或复水的雌蛹、雄成虫和雌成虫中分别被列为最不稳定的基因。然而，通过四种分析方法确定的大多数内参基因是不同的。类似地，先前的研究中不同程序之间的稳定性排名存在差异，这可能归因于不同的逻辑算法。因此，在本研究中，进一步使用了内参基因稳定性排名的综合分析。
18S rRNA和ACTIN参与基本细胞过程，是最常用于标准化表达的内参基因。然而，一些研究表明，18S rRNA和ACTIN并不总是可靠地用于标准化基因表达。在本研究中，发现在暴露于干燥或复水的三龄幼虫以及雄性或雌性蛹中，18S rRNA和ACTIN是合适的内参基因。其他研究报告了一致的结果。TUB在维持细胞形状、调节细胞分裂和促进物质运输中起着重要作用。RPS11在核糖体组装和蛋白质翻译中起着重要作用。EF1通过催化氨酰-tRNA的GTP依赖性结合在蛋白质翻译延伸中发挥作用。UBI对于蛋白质降解和细胞周期调控至关重要。这些基因已在各种昆虫物种中越来越多地被用作内参基因。我们的结果还表明，TUB、RPS11、EF1和UBI在不同实验条件下表现出高水平的稳定性。上述内参基因的组合是用于标准化二化螟在干燥或复水条件下表达的最佳基因组。为了进一步验证内参基因，分析了暴露于干燥或复水的二化螟不同发育阶段中Hsp60的表达模式。总的来说，结果表明，使用最稳定的内参基因或其组合标准化的Hsp60表达水平与使用最不稳定内参基因标准化的表达水平存在显著差异。
结论
昆虫进化出各种适应性生态策略和分子机制来应对湿度胁迫。然而，昆虫适应干燥或复水的分子机制仍然知之甚少。我们的研究系统地调查并验证了九个潜在的内参基因，用于标准化二化螟在干燥或复水条件下的qRT-PCR数据。我们的研究结果表明，二化螟内参基因的表达稳定性随发育阶段和性别在湿度胁迫下而变化。据我们所知，这是第一个在干燥或复水条件下验证昆虫内参基因的研究。这些发现将有助于未来研究二化螟湿度胁迫适应的分子机制。
